一、细胞生长缓慢
可能原因：
细胞的传代次数太多，细胞老化。
未选择合适的细胞收获时机，比如错过了对数生长期。
培养基、血清、缓冲液等质量差或配方不合理。
CO₂浓度与缓冲系统需求不匹配，导致 pH 控制不足。
微生物污染，尤其是支原体污染。
培养物光敏降解产生细胞毒性物质，比如培养基长时间暴露于荧光下。
不精确的细胞计数方法影响细胞生长。
解决方法：
获取新的、亚培养次数较少的细胞储存液。
在对数生长期后期收获细胞，当细胞达到 100% 融合后，生长会逐渐变慢，活跃度下降。
选用高质量的培养基及合理的试剂配方，若怀疑培养基有问题，可更换批次或供应商。
按照培养基中 NaHCO₃浓度调整培养箱内 CO₂浓度，例如 2.0g/L - 3.7g/L 浓度 NaHCO₃对应 CO₂浓度为 5% - 10%；也可加 HEPES 缓冲液至 10 - 25mM 终浓度；在 CO₂培养环境中改用基于 Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用 Hank′s 盐配制的培养液 12。
及时检查污染，做好支原体、器皿、环境消毒以及支原体清除等工作 2。
暗处保存细胞核培养基，避免荧光暴露。
确保计数样本充分混合，避免局部细胞密度差异影响精确计数，再次检查使用血球计数板进行细胞计数的所有运算。
二、细胞不贴壁
可能原因：
胰蛋白酶消化过度。
支原体污染。
培养液中无贴壁因子。
培养基 pH 值过碱（NaHCO₃分解）。
细胞老化。
接种细胞起始浓度太低或太高。
解决方法：
缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度 2。
分离培养物，检测支原体，清洁支架或培养箱，若发现支原体污染，丢弃培养物 2。
使用无菌醋酸溶液调整 pH 值或充入无菌 CO₂。
启用新的保种细胞。
调节最佳接种细胞浓度。
三、细胞生长不均匀
可能原因：
细胞或培养基的混合不充分。
培养箱内部温度不均一。
解决方法：
在培养基中接入细胞后应当轻摇混匀，在进入振荡培养箱后，保证持续稳定的振幅频率，避免局部浓度差异。
避免将培养器皿叠放，因为底部的培养器皿最靠近金属架可能加热最快；如果放在培养箱前部的培养器皿比后面的生长慢，要注意保持培养箱的门尽可能关严，并将前面的培养器皿移到后面。
四、培养液 pH 值变化太快
可能原因：
CO₂张力不对。
培养瓶盖拧得太紧。
NaHCO₃缓冲系统缓冲力不足。
培养液中盐浓度不正确。
细菌、酵母或真菌污染。
解决方法：
按培养液中 NaHCO₃浓度增加或减少培养箱内 CO₂浓度，如 2.0g/L - 3.7g/L 浓度 NaHCO₃对应 CO₂浓度为 5% - 10%12。
松开瓶盖 1/4 圈 12。
改用不依赖 CO₂培养液，加 HEPES 缓冲液至 10 - 25mM 终浓度 12。
在 CO₂培养环境中改用基于 Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用 Hank′s 盐配制的培养液 12。
丢弃培养物，或用抗生素除菌 12。
五、培养液出现沉淀
可能原因及解决方法12：
洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来。解决方法是用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
冰冻保存培养液。解决方法是将培养液加热到 37℃，摇动使其溶解，如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
沉淀但 pH 值不变：
沉淀且 pH 发生变化：细菌或真菌污染。解决方法是丢弃培养物，或用抗生素除菌。
六、细胞死亡
可能原因：
培养箱内无 CO₂。
培养箱内温度波动太大。
细胞冻存或复苏过程中损伤。
培养液渗透压不正确。大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为 260 - 350mosm/kg，加入额外试剂如 HEPES 或药物都有可能影响培养液渗透压。
培养液中有有毒代谢产物堆积。
解决方法：
检测培养箱内 CO₂2。
检查培养箱内温度 2。
取新的保存细胞种 2。
检测培养液渗透压，若有问题可调整培养液成分 2。
换入新鲜培养液，及时清除代谢产物积累 2。
七、悬浮细胞成簇
可能原因：
培养液中含钙、镁离子。
支原体污染。
蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放 DNA。
解决方法：
用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液 2。
分离培养物，检测支原体，如发现支原体污染，丢弃培养物 2。
用 DNase I 处理细胞 2。
在细胞培养过程中，一旦发现问题，要及时分析原因并采取相应的解决措施，同时做好记录，以便后续参考和改进。此外，严格的无菌操作、规范的实验流程和良好的实验环境对于细胞培养的成功也至关重要。如果问题持续存在或难以解决，建议咨询专业的细胞培养技术人员或相关机构。
