细胞培养是生物医学研究中的一项核心技术，广泛应用于药物开发、基因研究、癌症研究等多个领域。通过体外培养细胞，科学家们能够观察和研究细胞在特定条件下的行为及反应，为理解疾病机制和开发新疗法提供了重要依据。

一、实验原理

细胞培养的基础概念细胞培养是一种在体外模拟体内环境，将细胞置于人工控制的条件下进行生长和繁殖的技术。它允许研究人员在可控的环境中研究细胞的功能、反应和行为。研究人员可以通过体外培养细胞评估新药物的效果和毒性。

二、实验前准备

1. 实验室环境

确保无菌操作环境：生物安全柜、定期消毒、个人防护（实验服、手套、口罩）。

2. 器材和耗材准备

培养皿、培养瓶、移液器等灭菌处理或使用无菌耗材。

按需选择适合实验的培养瓶、培养皿。

3. 培养基的配制

配制培养基：添加血清（如胎牛血清）。

滤器过滤除菌，4℃保存。

4. 细胞复苏与冻存

细胞复苏：液氮中取出，37℃水浴解冻，迅速转移至培养基中。

细胞冻存：加入保护剂（如二甲基亚砜），避免温度剧变。

三、实验步骤

1. 细胞的复苏

解冻细胞：从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃的水浴中快速摇动，解冻时间应控制在1-2分钟内，直到冻存液完全融化。迅速进行下一步操作，以避免细胞暴露在非培养温度下过久。

转移细胞：使用无菌移液器将解冻的细胞悬液从冻存管中小心转移到装有温暖培养基的离心管中。缓慢加入培养基，避免产生气泡或细胞损伤。

离心：以1000转/分钟的速度离心5分钟，去除冻存保护剂（如DMSO）。离心后，小心吸去上清液，保留细胞沉淀。

重悬细胞：加入适量预热的培养基，轻轻吹打重悬细胞。确保细胞均匀分散，然后将细胞悬液转移到预热的培养瓶中。

培养：将细胞培养瓶放入培养箱中，37℃，5% CO2，开始常规培养。初次复苏后，建议在24小时内更换培养基，去除残余的冻存保护剂。

2. 细胞传代

观察细胞生长状态：使用倒置显微镜观察培养瓶中的细胞，当细胞覆盖培养瓶底部的80%-90%时，需进行传代操作。

准备消化液：准备含胰蛋白酶的消化液。常用的是0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。将胰蛋白酶放在37℃水浴中预热。

洗涤细胞：小心吸去培养基，用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）轻轻冲洗细胞表面1-2次，去除残留的血清和代谢产物。

消化细胞：加入适量预热的胰蛋白酶溶液，确保覆盖细胞层，放回培养箱中消化1-3分钟。期间可轻轻敲击培养瓶，观察细胞是否脱落。

终止消化：当细胞大部分从瓶壁脱落时，立即加入含血清的培养基（血清中的蛋白质会中和胰蛋白酶），终止消化过程。

收集细胞：将细胞悬液转移到离心管中，以1000转/分钟速度离心5分钟，收集细胞沉淀。吸去上清液，保留细胞沉淀。

重悬并接种：加入适量培养基重悬细胞，使用移液器轻轻吹打使细胞分散。根据所需细胞密度，将细胞悬液等分接种到新的培养瓶中，加入新鲜培养基，轻轻摇匀。

继续培养：将接种后的培养瓶放回培养箱，37℃，5% CO2，继续培养，并定期观察细胞的生长状态。

3. 细胞计数与活性检测

取样计数：从细胞悬液中取出10μL至20μL，用血球计数板进行细胞计数。将细胞悬液滴入计数板，使用倒置显微镜计数四个角落的大方格内的细胞数。

计算细胞浓度：根据计数结果，使用公式计算出每毫升细胞悬液中的细胞数量。公式为：总细胞数 = 计数细胞数 × 10^4 × 稀释倍数。

细胞活性检测：取样后，可以通过台盼蓝染色法检测细胞活性。将等量的台盼蓝溶液与细胞悬液混合，静置2-3分钟，用显微镜观察染色结果。存活的细胞不被染色，而死亡的细胞会被染成蓝色。计算存活率 = （未染色细胞数 / 总细胞数）× 100%。

4. 常见操作

换液：换液是为了提供新鲜营养和去除废物。操作时，先轻轻倾斜培养瓶，吸去旧培养基，加入新鲜培养基，确保不触碰细胞层。通常每2-3天换液一次。

细胞转染：细胞转染是将外源基因引入细胞的一种方法。常用的转染方法包括脂质体转染和电穿孔转染。转染前需优化条件，如DNA浓度、转染试剂比例等。转染后应监测细胞的转染效率和表达水平。

污染检测与处理：定期检查细胞培养物是否存在污染，如细菌、真菌或支原体。若发现污染，需立即处理，可能需要丢弃受污染的培养物，并对培养箱和操作环境进行全面消毒。

四、注意事项

无菌操作的重要性无菌操作是细胞培养成功的基础。在进行任何操作前，应彻底清洁双手，穿戴无菌手套，并在生物安全柜中完成所有操作。移液器、培养皿等器材的使用应严格遵循无菌操作规范，避免交叉污染。