对照在流式实验中的重要性
信号相对性：流式细胞术测量的信号（散射光信号和荧光信号）都是相对于背景的，需要对照来界定这些信号的范围，区分背景荧光和实验信号。
门的位置设定：对照帮助确定选择特定细胞群体的门的位置，确保对目标细胞群体的准确分析。
实验操作判断：对照有助于识别实验过程中可能出现的问题，如染色不均匀、仪器设置错误等，确保实验的可靠性。
常用对照类型
1.空白对照：
定义：未添加任何荧光抗体或染料的原始单细胞悬浮液。
用途：展示细胞的自发荧光，调节仪器的电压或增益，确定阴性细胞群的大体位置。
限制：不适用于多色实验中精确界定阴阳性细胞群的界限。
2.同型对照：
定义：与使用的流式抗体具有相同种属来源、亚型、荧光标记物、使用剂量和浓度，但对目标靶点无特异性结合的抗体。
用途：排除非特异性染色，特别是在表面有Fc受体的细胞中。
限制：在多色实验中设定门的界限时，一般不用同型对照，而是用FMO对照。
3.FMO (fluorescence minus one)对照：
定义：除了要观察的荧光染料不标记，其它所有的荧光素都进行标记。
用途：评估其他染料对检测通道荧光素的影响，辅助设定门界限，尤其在多色实验中。
4.同种型和FMO联合对照：
定义：FMO对照中省略了一种抗体偶联物，用同种型对照抗体代替，结合考虑溢出和非特异性结合。
考虑：尽管理论上结合了两种对照的优势，但同种型对照可能具有与测试抗体不同的非特异性结合特性，需要滴定以匹配。
5.生物学对照：
定义：包括阴性对照和阳性对照，用于界定阳性细胞门的位置和验证实验操作。对于功能分析，如细胞内细胞因子染色（ICS）中的细胞因子，最佳门控对照可能是来自同一供体的未刺激细胞。
用途：阴性对照如未加药、未刺激或未活化的样品；阳性对照用于验证实验操作本身有没有问题。
6.单阳对照：
定义：标记了一种荧光抗体的样本管，可以是细胞也可以是补偿微球单染。
用途：用于补偿调节、参照光谱创建，确认电压设置是否需要进一步优化。
7.内部对照：
定义：只在特定亚群上表达的marker，可以在亚群设门后观察其表达情况。
用途：帮助判断门控、方案和实验流程的准确与否。
对照的优化和作用
1.未染色对照：确保无荧光素污染，与样品类型相匹配，用于AF评估。
2.单染细胞对照（SS cell controls）：作为补偿调节/参照光谱创建对照，评估标记物的补偿后/解混表现以及多色方案配色效果，提示方案优化方向。
3.设门对照（Gating controls）：FMO对照/同种型联合对照用于设置阳性和阴性事件之间的边界，评估方案表现。
4.核心组合与全染FS方案：首先使用核心组合逐步确认方案设计的质量，然后添加额外标记进行详细分析。
5.固定/破膜缓冲液：选择适合被检测标记物的试剂，考虑其对染色的影响并充分验证，确保染色的准确性和一致性。
总结
通过这些详细的对照类型和应用，可以确保流式细胞术实验的准确性、可重复性和数据的质量，从而提高实验结果的可靠性和科学价值。
