活性氧（ROS）是氧代谢的天然副产物，正常情况下，机体含量较低。当机体受到损伤刺激时，如药物毒性、缺氧等，ROS水平会急剧增加，超过机体自身清除能力时，机体氧化-抗氧化作用失去平衡，从而导致细胞膜破坏，最终引起机体细胞死亡。因此，ROS的测定有助于判断细胞损伤情况。
基本原理：目前检测细胞内ROS水平常用的是DCFH-DA荧光探针法。DCFH-DA可以自由穿过细胞膜，本身没有荧光。细胞内的酯酶可将DCFH-DA水解生成不能通过细胞膜的DCFH，这样使得探针在细胞内形成积聚。经过经细胞内ROS的氧化，DCFH可转变为有荧光的DCF，且荧光的强度与ROS的水平成正比。
实验流程
以下是流式细胞仪检测贴壁细胞ROS的实验步骤及注意事项。
实验步骤：
1、准备细胞：将目的细胞均匀铺至六孔板中，实验组和对照组分别做相应处理，并预设空白管（即不装载探针）。至细胞密度达到80%-95%。
2、清洗：用PBS将六孔板中细胞分别清洗1-2次，并弃去PBS。
3、消化：用胰酶将六孔板中细胞消下来，移至1.5mlEP管中，并做好标记。
4、离心：1200r，常温，离心5min。
5、探针配制：按照2μl DCFH-DA原液：3ml无血清培养基配制，上下颠倒混匀（注意避光）。
6、加入探针：弃去4中培养基，空白管加入1ml无血清培养基，其余均加入1ml配制好的探针液，并重悬细胞（注意避光）。
7、孵育：37°C避光孵育20min。
8、离心：1200r，常温，离心5min，弃去上清。
9、清洗：用1ml冷PBS清洗，1200r，常温，离心5min，弃去上清，重复2次（注意避光）。
10、上机：将细胞用500μl冷PBS重悬，并移至流式管，上机。
注意事项：
1、消化细胞时，以细胞刚好掉落为好，不可时间过长，避免过度消化造成细胞损伤而影响实验结果。
2、探针配置时，一般按照1：1000用无血清培养基稀释DCFH-DA（终浓度为10Μm），不同的细胞系条件有所不同，需自行摸索。
3、加入探针后，一定要充分混悬细胞，以保证探针完全结合。
4、探针孵育时，每隔3-5min需颠倒混匀。
5、探针孵育时间不同细胞可能会不一样，一般为20-30min。
6、最佳激发波长为488nm，最佳发射波长为525nm。
