一、技术原理
1.基本概念：
抗体：能够特异性识别抗原的免疫球蛋白分子。
抗原表位：抗体结合的特定抗原区域，通常是蛋白质分子表面的一段氨基酸序列。
酶标记：检测抗体通常标记有酶（如辣根过氧化物酶，HRP），通过催化底物显色实现信号放大。
2.工作原理：
三明治ELISA利用两种抗体与目标抗原相互作用：
捕获抗体（coating antibody）：固定在微孔板底部，特异性结合目标抗原。
检测抗体（detection antibody）：识别并结合抗原的另一个非重叠表位。检测抗体通常与酶（如HRP或碱性磷酸酶）共轭，或者通过间接结合次级抗体进行检测。
3.显色反应：
检测抗体上的酶催化底物生成有颜色的产物，颜色的深浅与抗原浓度成正比。最终通过光密度（OD）值定量分析目标抗原的浓度。
二、实验步骤
1.试剂准备：
捕获抗体：单克隆抗体（monoclonal antibody），特异性强。
检测抗体：通常为酶标抗体，或配合酶标二抗使用。
底物：常用的显色底物包括四甲基联苯胺（TMB）或对硝基苯磷酸酯（pNPP）。
2.实验流程：
捕获抗体涂板：将捕获抗体均匀涂布于96孔板中，4℃孵育过夜，使其牢固结合于孔底。
封闭：加入封闭液（如含牛血清白蛋白的PBS缓冲液）覆盖未结合区域，防止非特异性结合。
样品孵育：加入待测样品（如血清或血浆），含目标抗原的样品会与捕获抗体结合。
洗涤：使用洗涤液（PBS-Tween）多次冲洗孔板，去除未结合的杂质。
检测抗体孵育：加入检测抗体，识别并结合抗原的不同表位。
洗涤：再次洗去未结合的检测抗体。
显色反应：加入酶底物（如TMB），酶催化反应后生成有颜色的产物。
终止反应：加入终止液（如硫酸），稳定颜色。
读板：在酶标仪上测定吸光度（一般为450nm），根据标准曲线计算抗原浓度。
三、技术优势与局限性
1. 技术优势：
高灵敏度：比直接和间接ELISA高2-5倍，适合低浓度目标抗原的检测。
高特异性：捕获抗体和检测抗体识别抗原的不同表位，降低了非特异性信号。
适用范围广：可检测多种生物标志物（如激素、炎症因子、病原体抗原）。
2. 技术局限性：
抗体优化复杂：捕获抗体和检测抗体必须识别不同表位，且避免交叉反应。
标准化要求高：实验条件需严格控制，包括抗体浓度、孵育时间和洗涤步骤。
试剂成本高：高质量单克隆抗体和底物价格昂贵。
举例设计
检测TNF-α的血清浓度：TNF-α是重要的促炎因子，其水平在炎症和自身免疫疾病中显著升高。
实验设计：
捕获抗体靶向TNF-α的一个表位。
检测抗体靶向TNF-α的另一个非重叠表位，酶标记。
建立TNF-α的标准曲线，测定不同浓度的吸光度（OD）。
根据标准曲线计算病人血清中的TNF-α浓度（单位：ng/mL或pg/mL）。
