失败经验+步骤总结：看似简单的细胞划痕实验

看似很简单的基础“划痕”实验，在实际操作中也会栽跟头，状况百出，像细胞铺板数量过多/过少、划痕不均一、细胞不迁移、如何快速进行数据统计等诸多问题我们在自己做的时候也都碰到过。所以这篇内容就是基于自己前期的一些失败的教训，给大家做一点问题总结。
细胞划痕实验的基本概念
细胞划痕实验是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外实验方法。
这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白无细胞区域（称为“划痕”），然后对这个无细胞区域的细胞进行观察。
如果这些划痕边缘的细胞逐渐进入空白无细胞区域，使“划痕”愈合，说明细胞有迁移能力。因这个过程类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验（Wound-Healing Assay）。

如下图所示：

细胞迁移动态图

优点：
1）一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程；
2）适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。
3）配合活细胞显微成像可用于分析细胞间的相互作用。
4）成本低、操作简单。
该实验方法常用于研究肿瘤细胞的侵袭转移能力和细胞基质对于细胞迁移的影响，广泛用于可以观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。

平板划痕实验步骤
在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后再继续培养细胞至实验设定的时间（可有不同时间点），取出细胞培养板，在显微镜下进行拍照记录，获得多个时间点的图片序列，之后定时测量划痕的宽度，进而得到伤口愈合的细胞迁移数据。
该实验适用于检测培养的细胞（贴壁细胞），不适用于检测组织样本。
并非所有细胞都适合划痕实验，以乳腺癌为例，乳腺癌细胞MCF-7几乎很难迁移，而MDA-MB-231具有很强迁移性。
所以，细胞的选择需要考虑细胞自身的迁移能力，一般需要迁移强的细胞，而且对无血清的环境有较强的忍受力（至少24h）。然而很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12h细胞凋亡就超过50%，因此细胞划痕法对部分肿瘤细胞并不适用。

1.【实验材料】（做细胞划痕实验，基本上不需要额外买设备）
①细胞培养平板，一般使用6孔板，大小合适，便于划线和观察（6孔板可以保证有相当距离的平直划痕，而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个可固定监测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题）；
②marker笔，用于标记；
③直尺，用于观察时对细胞划痕宽度测量；
④20微升枪头，用于在单层细胞上划痕；
⑤无血清培养基
⑥PBS
注：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前于超净工作台内紫外线消毒至少30min。
2.【具体操作步骤】
（1）培养板划线标记
首先使用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划平行线（线要直），各水平线间的间距为0.5-1cm，每孔至少画5条水平线，方便之后镜下观察每个区域。划线时注意线不要太粗。

（2）细胞铺板
胰酶消化细胞，制备细胞悬液。细胞计数后铺板，保证每组细胞铺板密度一致，一般在孔内接种约5-10×105个细胞（可根据细胞的生长快慢调整接种数量）。
一些需要注意的小tips：

实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同类型细胞要观察细胞贴壁率等，确定实验时细胞种板数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。为了获得更好的实验结果，可在做实验之前进行一次预实验。

细胞种板密度原则为过夜后融合率达到100%。若过夜后细胞未100%融合，虽可以适当延长培养时间，但因细胞密度已经很大，所以细胞状态会逐渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡。

一定要等到细胞铺满，彼此之间没有空隙，否则会影响后续数据分析。

（3）制造划痕
待细胞铺满后，用直尺比着，使用20ul枪头垂直于孔板和线制造细胞划痕，使划痕与标记线相交。
一些需要注意的小tips：
枪头要垂直，不要倾斜。
尽量保证各个划痕宽度一致。

①不同孔之间最好使用同一只枪头。

②最好保持力度一致，尽量一次性划完。
按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决前后观察时位置不固定的问题，确保拍照观察点固定。例如划痕一次与5条定位线相交，就有10个监测点。

手动划痕，难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果。有时候在划细胞的同时会刮坏一片细胞，对划痕的边缘的细胞造成机械损伤。有条件的话，可选择culture Insert，将细胞接种于Dish中间的Insert，培养。细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500μm宽度的划痕。

（4）洗细胞，去除划下的细胞，换液
划痕完成后用显微镜照相，作为0h对照。吸去旧培养基，再使用无菌PBS洗细胞3次，洗去划下的细胞，使留下的间隙肉眼即清晰可见。然后加入新鲜无血清或低血清（<2%）的培养基。
根据需要设加实验组、对照组。不需加药的空白对照组只需添加等量的无血清培养基即可，药物干预组加入含药物的无血清培养基。
一些需要注意的小tips：
在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞；反复多次冲洗，尽量洗掉所有的细胞碎片，否则会影响拍照效果。
为了避免细胞数量和状态受到影响，尽量不要用吸泵，可用移液枪缓慢吸走。
划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素（1μg/ml）处理1h，抑制细胞的分裂，这样结果就是细胞迁移的作用了。
另外，划出划痕后，把培养基换成无血清的培养基（有的细胞对无血清不耐受，可以少加点血清，维持细胞的状态），可以降低增殖对实验结果的影响。虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。

（5）细胞培养与定时拍照观察
将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中培养。然后在适当的时间点（根据个人实验需要）取出细胞，在显微镜下观察划痕宽度并拍照。
一些需要注意的小tips：
一般按0，6，12，24小时拍照，建议不要把观察时间设置的太长，因为很容易造成细胞污染死亡或者过度增殖造成的假阳性结果。
以预先做好的标记为定点观测点来进行定时拍照（选择处理/对照组迁移能力差异明显的时间点拍照，拍摄与0h拍照时的相同位置，放大倍数相同）。
拍照时标记线不要出现在视野内，而是刚好沿着标记线的边拍照。
细胞生长具有边缘效应，所以边缘细胞生长状态可能与中间的细胞不太一样，不宜作为观测点。
（6）数据分析
划痕实验统计分析主要有两种方法，一种是统计细胞迁移的距离；一种是统计划痕面积。
①细胞迁移距离
结果分析：每个时间点的距离长度— 0h距离 = 每个时间长度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴，迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0h与实验结束时实验组与对照组的照片。