在分子生物学研究中，提取高质量的RNA是实验成功的关键一步。广泛使用的RNA提取方法——TRIzol法。
一、TRIzol提取RNA的原理
TRIzol是一种含有酚和氯仿的试剂，可以有效地分离出RNA、DNA和蛋白质。其工作原理基于物质的溶解性差异。在高盐环境中，RNA、DNA和蛋白能够在不同的有机相和水相中分层。
具体来说，当样本在TRIzol中裂解后，加入氯仿并离心，系统会分成上层的水相、中间的蛋白质相和下层的有机相。RNA位于上层水相中，而DNA和蛋白则分别留在有机相和界面相中。
二、实验步骤
1：样本裂解
将细胞样本收集后，直接加入1ml TRIzol试剂。确保每10^6个细胞使用1ml TRIzol。
完全裂解细胞，可以在室温下孵育5至10分钟，确保细胞彻底裂解。
2：相分离
向裂解的样本中加入0.2ml氯仿，每1ml TRIzol。
闭合瓶盖，强烈震荡15秒，使混合物均匀。
室温静置2-3分钟后，高速离心15分钟（12000g, 4°C），使混合物分层。
3：RNA沉淀
轻心吸取上层含RNA的水相，转移到新的离心管中。
向吸取的水相中加入0.5ml异丙醇，混匀后室温静置10分钟，促使RNA沉淀。
再次高速离心10分钟（12000g, 4°C），沉淀RNA。
4：RNA洗涤
弃去上层液体，留下RNA沉淀。
加入1ml 75%乙醇，洗涤RNA沉淀。
短离心（7500g, 5分钟, 4°C），弃去洗涤液。
5：RNA溶解
在室温下风干RNA沉淀5-10分钟。
加入适量无核酸酶水或1% DEPC处理的水溶解RNA，通常30-50μL即可。
三、注意事项
避免RNA降解：在整个实验过程中，应避免RNA酶污染，实验操作尽量在无菌条件下进行，使用无RNA酶的试剂和耗材。
样本处理速度：从添加TRIzol到样本裂解应迅速进行，避免RNA降解。
氯仿的使用：加入氯仿后一定要充分震荡，保证完全混合。
温度控制：离心步骤建议在4°C下进行，以保持RNA的完整性。
RNA溶解：RNA沉淀通常难以完全溶解，溶解时轻轻摇动管子，避免直接吹打沉淀。
