流式细胞术的原理
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种能够对悬浮于流体中的细胞或其他微小颗粒进行快速（上机后1-2min即可完成检测）、精确的多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪主要包括液流系统（由流动室和液流驱动系统组成）、光学系统（由激发光源、光束形成器和光信号收集通道组成）和电子系统（由光电转换器、前置放大器、模拟转换电路和数据处理系统组成），使用荧光标记的抗体来检测细胞表面或内部的特定抗原，并结合激光诱导的信号检测，通过将细胞悬液以单列形式通过激光束，细胞在激光照射下会产生散射光和荧光信号。这些信号被光电倍增管接收并转换为电信号，经过放大和数字化处理后，实现了对细胞复杂特性的全面评估。

流式细胞术的应用非常广泛，包括免疫学、血液学、肿瘤学、干细胞研究等领域。它能够实时捕捉细胞状态的动态变化，为细胞生物学的动态过程研究提供了可能，并且具有高通量、高灵敏度和高特异性的特点。

一、流式细胞术的简要分析步骤
样品制备：

首先将待测细胞制备成单细胞悬液，并通过荧光染色处理。

流式细胞计数中常用的荧光染料包括：

1.异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）：这是一种广泛使用的绿色荧光染料，常用于标记细胞表面的特定抗原，常与抗人CD3、CD4、CD8等抗体结合，用于标记T细胞亚群。

2.藻红蛋白（Phycoerythrin，PE）：PE是一种橙黄色荧光染料，具有较高的亮度，适用于标记低丰度抗原。

3.多甲藻叶绿素蛋白Cy5.5（Peridinin Chlorophyll Protein，PerCP-Cy5.5）：是一种红色荧光染料，发出红色荧光，适用于与635nm激光器配合使用的流式细胞仪。

4.Alexa Fluor系列：这是一系列荧光染料，具有高光量子产率和良好的光稳定性，适用于多种流式细胞仪配置。

5.别藻蓝蛋白（Allophycocyanin，APC）：APC发出远红荧光，常用于多色流式细胞术中，与其他荧光染料配合使用，以区分和分析多达六种或更多的细胞表面或内部标记物。

6.碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）：PI是一种核酸染料，常用于检测细胞凋亡和死细胞。

7.7-氨基放线菌素D（7-Aminoactinomycin D，7-AAD）：7-AAD也是一种核酸染料，与PI类似，但其发射光谱较窄，对其他检测通道的干扰更小。

二、流式细胞仪检测：
1.液流聚焦：通过高压将样品和鞘液（特征：等渗；通常是PBS）混合，形成单个细胞在鞘液中单行排列的流束。

2.激光激发：使用激光作为光源垂直照射样品流，细胞在激光照射下会产生荧光和散射光。

3.信号检测：前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）由光电二极管检测，而荧光信号则通过光电倍增管接收并分离成不同波长。

4.信号处理：检测到的电信号经过放大、滤波、数字化和计算机处理，转换为数字信号，通过设定合适的阈值和参数范围，对细胞群体进行分选、计数、比例计算等。

5.数据分析：利用专门的流式细胞数据分析软件对数据进行处理和分析，以得到细胞的数量、特征等多种参数。

三、注意事项：

1.在整个样品制备过程中，应尽量减少细胞死亡和碎片的产生，以保证流式细胞仪检测的准确性。

2.样品的处理和染色应在适宜的温度下进行，以保持细胞的完整性和荧光信号的稳定性。
 

四、流式细胞计数VS传统细胞计数的优势
1.速度快：流式细胞术能够高速分析上万个细胞，每秒钟可以处理数千甚至上万个细胞，而传统细胞培养的分析速度相对较慢。 

2.多参数分析：流式细胞术可以同时从单个细胞中测量多个参数，如细胞大小、颗粒性、表面抗原和细胞内分子等，而传统细胞培养通常只能提供有限的信息。 

3.高灵敏度和精度：流式细胞术能够检测低浓度的细胞标记物，具有更高的分辨率和精确度，这对于早期诊断和疾病监测尤为重要。 

4.自动化程度高：流式细胞术的自动化程度较高，减少了人为误差，提高了实验的重复性和准确性。 

5.无害性：在流式细胞术中，细胞可以在不受破坏的情况下进行分析和分选，这对于保持细胞的活性和功能至关重要。 

6.细胞分选能力：流式细胞术不仅可以分析细胞，还可以将具有特定特征的细胞分选出来，用于进一步的研究或应用。 
7.应用广泛：流式细胞术在免疫学、肿瘤学、血液学等多个领域都有广泛的应用，可以用于研究细胞的功能、药物筛选、疾病诊断和治疗监测等。