在培养细胞时,去除血清来源的外泌体是一个关键步骤,以避免对外泌体研究的干扰。以下是一些常用的去除血清中外泌体的方法:
一、超速离心法
超速离心法是一种常用的去除血清中外泌体的方法。具体操作为:将血清稀释后,在4℃条件下以10万g(或1×10^5g)的速度离心持续90分钟至10小时以上,以沉淀外泌体。为了确保去除效果,通常会进行两次离心并取上清液。这种方法可以有效地去除血清中至少98%的外泌体,但需要使用超速离心机这一特殊设备。
二、使用无外泌体血清培养基
1.完全替代:可以选择无血清完全替代培养基进行细胞培养,从而避免血清中外泌体的干扰。这种方法适用于那些可以在无血清环境中生长的细胞。
2.部分替代:在细胞正常含血清的培养基中培养一定的时间后,当细胞汇合度达到60%~70%时,移去原有含血清的培养基,换成新鲜的无外泌体血清培养基,继续培养24~48小时,待细胞汇合度达到80%~95%左右时收取上清液。该上清液即可用于提取外泌体。
另外,还可以使用外泌体专用无血清培养基。在细胞汇合度约为50%时,移去原有完全培养基,添加新培养基进行培养。新培养基由50%外泌体专用无血清培养基和50%完全培养基组成。待细胞生长汇合度约为70%80%时,移去培养基,使用1×PBS溶液将细胞润洗23次,再加入外泌体专用无血清培养基继续培养2448小时,待细胞汇合度达到80%95%时收取细胞培养上清液,该上清液即可用于外泌体提取实验。
三、购买商业化的去外泌体血清
如果条件允许,可以直接购买商业化的去外泌体血清。这些血清已经经过特殊处理,去除了外泌体,从而避免了对外泌体研究的干扰。但需要注意的是,应选择正规、可靠的厂家购买,以确保产品质量。
四、超滤法
超滤法也可以用于去除血清中的外泌体。原理是滤膜上可以允许小分子通过,但大分子如外泌体则无法通过。因此,可以通过滤膜去除血清中的外泌体。然而,这种方法可能需要特殊的超滤设备和滤膜,且操作相对复杂。
五、注意事项
1.在去除血清中外泌体的过程中,应确保操作的无菌性,以避免细胞污染。
2.不同细胞对外泌体的需求和敏感性不同,因此应根据具体细胞类型选择合适的去除方法。
3.在去除血清中外泌体后,应定期检测细胞生长状态和外泌体含量,以确保细胞正常生长和外泌体的有效提取。
综上所述,去除血清来源的外泌体有多种方法可供选择,包括超速离心法、使用无外泌体血清培养基、购买商业化的去外泌体血清以及超滤法等。在选择具体方法时,应根据实验需求、细胞类型以及设备条件等因素进行综合考虑。