一、基本原理

荧光定量PCR（qPCR）技术，作为现代生物科学领域的一项核心工具，广泛应用于基因表达分析、病毒检测和癌症研究等多个领域。

 

qPCR技术融合了传统PCR的基本原理和先进的荧光检测技术，能够精确地测定特定DNA序列的数量。它不仅提高了实验的灵敏度和准确度，还大大缩短了实验时间。

 

在进行荧光定量PCR（qPCR）实验之前，确保所有必需的试剂和设备已经准备就绪是至关重要的。这不仅有助于实验的顺利进行，还能确保数据的准确性和可靠性。

 

二、 实验材料与设备准备

主要试剂

模板DNA：这是qPCR实验的起点，需要从相关样本中提取高质量的DNA。

引物：特异性设计的引物对于目标DNA的扩增至关重要。

探针：通常标记有荧光物质，用于在PCR反应中实时监测DNA的扩增情况。

dNTPs：四种脱氧核苷酸的混合物，为DNA合成提供原料。

聚合酶：一般使用热稳定的DNA聚合酶，如Taq聚合酶，它在高温PCR反应中非常稳定。

 

实验设备

PCR仪：用于进行热循环，使DNA模板在特定温度下反复扩增。

离心机：用于样品的混合和快速沉降，确保反应物均匀分布。

移液枪：精确移取和添加微小体积的液体，保证反应体系的准确配置。

 

样品准备

样品的采集、存储和预处理是实验成功的基础。采集后的样品应立即处理或存放在-20°C以下以防止DNA降解。

 

DNA的提取应按照标准化操作流程进行，确保提取的DNA纯度和浓度符合实验要求。在实验前对样品进行适当的稀释和处理，可以避免可能的抑制因素影响PCR反应的效率。

 

三、实验操作步骤

在荧光定量PCR（qPCR）实验中，精确的实验操作步骤是确保数据准确性和重复性的关键。

 

以下是详细的步骤和注意事项

引物和探针设计

引物和探针的设计是qPCR实验成功的基石。设计应确保高度的特异性，以避免非特异性扩增：

引物长度：通常在18到24个碱基之间，这有助于确保扩增效率和特异性。

熔解温度（Tm）：引物的Tm应相近，通常设置在58°C到60°C之间，以优化退火温度。

GC含量：控制在40%到60%之间，以防止结构不稳定。

避免二聚体：设计时应检查引物间的互补性，避免可能的二聚体形成。

 

反应体系的建立

配置PCR反应混合物时，每一组分的比例和添加顺序都至关重要：

模板DNA：根据目标基因的丰度调整模板量，通常范围在1至10 ng。

引物和探针：每个引物和探针的最终浓度通常设定在200 nM至400 nM。

聚合酶和dNTPs：使用厂家推荐的聚合酶和dNTPs浓度，确保酶的活性和反应的效率。

缓冲液和Mg2+：确保pH和离子强度适宜，通常按照试剂盒推荐的配方进行。

 

PCR扩增条件设置

扩增程序的设定直接影响PCR的效率和特异性：

预变性：通常设定在95°C，持续时间为2至3分钟，以确保DNA完全变性。

退火：根据引物的Tm设定退火温度，通常在55°C到65°C之间，持续时间为20至30秒。

延伸：设定在72°C，每1 kb DNA延伸1分钟。

循环次数：通常进行40至45个循环，足以放大大部分目标序列。

 

数据收集与分析

数据收集：荧光定量PCR仪将在每个循环结束时收集荧光数据，监测DNA的实时扩增情况。

数据分析：使用相应的软件评估扩增曲线，计算每个样本的CT值（循环阈值），并通过比较不同样本的CT值来定量表达差异。

 

每一步骤的精确执行都是确保qPCR实验成功的关键。遵循这些指南将帮助您获得可靠和一致的实验结果。

 

四、注意事项

在进行荧光定量PCR实验时，确保结果的准确性和可重复性是至关重要的。

 

以下是一些关键的注意事项，旨在帮助研究人员避免常见错误并优化实验条件。

防止污染

独立工作区域：设定专用的PCR实验区，避免与DNA提取和其他实验活动区域重叠，减少交叉污染的风险。

使用一次性消耗品：如可能，使用一次性移液管尖和实验容器，减少重复使用导致的污染。

适当防护装备：实验人员应穿戴实验服、手套和口罩，尤其是在开放样品和处理试剂时，以防止带入外源性DNA。

引物特异性引物设计检验：在实验之前，使用生物信息学工具检查引物的特异性，确保它们不会与非目标DNA序列发生扩增。熔解曲线分析：每次实验后进行熔解曲线分析，以确认扩增产物的特异性。非特异性扩增通常表现为曲线上的多个峰值。

 

荧光信号的优化

荧光探针的选择：选择高质量的荧光探针，确保其与引物配对良好，以提高信号的稳定性和可检测性。

防止荧光淬灭：妥善存储所有含有荧光标记的试剂，避免长时间暴露于强光下，以防荧光标记降解。

信号阈值设置：合理设置仪器的信号阈值，确保在动态范围内捕捉到所有相关的荧光信号变化，避免因设置过高或过低而漏检或误检。