原代细胞分离培养与鉴定用于从组织或器官中分离出原始的、未经过传代的细胞，并进行培养和鉴定。
原代细胞分离常用的方法有悬浮离心法、直接组织块法、酶消化法、机械分散法等。
原代细胞分离培养与鉴定的应用广泛，可以用于研究细胞生物学、细胞功能、细胞信号传导、细胞分化、细胞增殖等方面的问题。
此外，原代细胞还可以用于药物筛选、毒性测试、疾病模型构建等研究领域。
一、材料准备
培养基、血清、胰酶、滤网、15/50mL离心管、剪刀、注射器、细胞筛、细胞瓶/板、移液枪等
二、实验步骤
1、悬浮细胞的分离
组织若来源于血液、胸水、腹水、脏器灌洗液等，可以收集直接800~1000rpm，离心5~10min，若细胞悬液较多，可分份分批离心，切勿离心时间过长、转速过高，细胞堆积过多，避免造成细胞机械性损伤。随后用无菌PBS清洗1遍，培养基清洗2遍，通过细胞计数适当调整密度传瓶或板。
2、组织细胞的分离
对于组织，可采用机械分散法或酶消化法将组织内的细胞分散。
2.1 机械分散法
若所需组织质地较软、纤维成分较少，可直接将组织剪碎，放入细胞筛中，用注射器钝端进行挤压，使细胞从网孔中筛入培养基中，吸管反复吹打混匀，37℃静置3~5min，待组织块沉降后，吸取上清进行清洗等。此方法对细胞组织的机械性损伤较大，分散效果较差，只适用于脑等组织。
2.2 酶消化法
用无菌PBS对组织进行清洗，洗去组织中的血液；放入50mL离心管中剪刀剪碎；按1mL：100mg的比例加入胰酶（胶原酶、分散酶、胰蛋白酶）放置37℃消化15~30min（也可提前4℃放置6~12h，使无活性的酶渗入到组织内再37℃），中途每隔5min轻轻摇匀一次，若组织块蓬松出现絮状物，加入3倍体积的10%DMEM中止消化，吹匀，37℃静置3~5min，转移上清，用细胞筛进行过滤，800~1000rpm离心4min，弃上清，加入无菌PBS清洗细胞3次，调整细胞浓度进行培养。若提取的细胞量较少，可对组织块用PBS清洗，进行短时间多次消化以获得更多的细胞。
注：当组织细胞比较杂时，可通过时差贴壁法进行除杂：成纤维细胞1~2h贴壁；角化细胞4h；胶质细胞1h；神经细胞8~10h；
三、原代细胞的传代
传代前应先观察细胞密度及活性，活率应该超过90%、密度在80%，进行传代时，应提前了解细胞的特性，若贴壁较紧的细胞，可进行湿消化；若贴壁不紧，可进行干消化。
每隔30s观察一次，当显微镜下细胞间隙变大，周围变亮时，中止消化，轻微吹打混匀，进行传板/瓶，密度稍微密一点，一般原代细胞可传3~4代。
无血清培养基培养的细胞，可用大豆胰蛋白酶抑制剂进行中止。
