一、 CFSE细胞增殖实验简介
CFSE（羧基荧光素琥珀酰亚胺酯）染料是生物医学研究中常用于标记活细胞的荧光探针。由于其能够穿透细胞膜并与胞内蛋白质共价结合，CFSE在细胞分裂过程中均匀分配给子细胞，使研究者能够追踪细胞的增殖和分裂历史。
二、 实验原理
CFSE染色的基本原理是利用其荧光特性来观察和量化细胞分裂。CFSE分子可以透过活细胞的细胞膜，进入细胞后通过非特异性的酯酶活性被转化为更加亲水的形式，与细胞内蛋白共价结合。在细胞分裂时，荧光标记的CFSE将均匀分配到两个子细胞中，由于分裂的每次过程荧光信号都会减半，通过流式细胞仪可以准确测定细胞的分裂次数。
三、 实验前的准备
1.材料与设备
进行CFSE细胞增殖实验需要准备以下
材料和设备：无菌操作台、流式细胞仪、高质量的CFSE染料、细胞培养盘、培养基、离心机、冰箱等。
所有材料和设备应保证处于良好的工作状态，以确保实验结果的可靠性。
2.细胞培养与染料配制
在实验前需培养足够数量的健康细胞。
选择合适的细胞线和培养条件对实验结果至关重要。
CFSE染料的配制需要在避光条件下进行，按照推荐浓度将CFSE溶解于适宜的缓冲液中，
并通过过滤确保溶液的无菌。
3.实验技巧
为确保细胞活性和最佳染色效果，以下几点至关重要：
细胞密度：避免过密或过稀，以保证细胞生长环境和染色效果。
染色时间和温度：根据细胞类型调整染色时间，通常在37°C下孵育。
快速操作：从加入染料到洗涤细胞，整个过程应迅速进行，避免荧光的光解。
4. 实验步骤详解
CFSE染色细胞过程
细胞收集与计数：使用细胞收集器收集细胞，并通过细胞计数仪确保获得准确的细胞数量。
染色准备：将预先配制好的CFSE染料按照所需浓度加入到细胞悬浮液中，通常浓度为1-10 µM。
染色过程：将含染料的细胞悬浮液在37°C、5% CO2的条件下孵育20-30分钟，确保染料完全渗透细胞。
终止染色：加入5倍体积的冷PBS或培养基，以快速降低染料浓度，停止染色过程。
洗涤步骤：通过离心洗涤细胞至少三次，以去除未结合的染料。
重悬细胞：使用新鲜培养基重悬细胞，准备进行流式细胞分析。
孵化、清洗及细胞分析
细胞需在适宜的培养条件下继续孵化至少24小时，以允许足够的细胞分裂。
清洗过程中，确保使用冷的PBS冲洗细胞，以最小化细胞的代谢活动和可能的细胞死亡。
在流式细胞仪分析前，再次计数和调整细胞密度，确保数据的准确性。
流式细胞仪设置
使用488 nm激光激发CFSE，并收集对应的绿色荧光信号。
调整流式细胞仪的电压和增益，以获得最佳的荧光信号分辨率。
对每个样本进行至少10,000个细胞的数据采集，确保统计数据的代表性和可靠性。
