一、 引言

简介
Calcein-AM/PI细胞活死双染是一种流行的荧光染色技术，用于区分活细胞和死细胞。

Calcein-AM是一种可渗透细胞膜的非荧光前体，它在活细胞中由内源性酯酶转化为绿色荧光的Calcein，表明细胞活性。

丙啶碘（PI）是一种不能穿透完整细胞膜的红色荧光染料，只在死细胞中染色，因为它们的膜完整性受损。

 

实验意义
这种双染方法在评估细胞毒性实验、药物筛选和细胞健康状态监测中尤为重要。

它为研究者提供了一种快速、直观的手段来评估和记录药物处理或基因操作后的细胞存活率和死亡率。

 

二、实验前的准备

1.所需材料

Calcein-AM：通常预配2 mM的储备液，在使用前根据需要稀释。

丙啶碘（PI）：常见的配制浓度为1 mg/mL。

培养基：选择与细胞类型兼容的培养基，如DMEM或RPMI。

消耗品：包括无菌吸头、移液器、培养板等。

2.设备准备

荧光显微镜：用于观察和拍摄Calcein-AM和PI的荧光。

离心机：用于细胞收集和洗涤。

培养箱：维持适宜的培养条件，如温度和CO2浓度。

3.试剂配制

Calcein-AM和PI应在避光条件下稀释和储存，以防光解和氧化。

严格按照产品说明书配制，保证实验的重复性和准确性。

 

三、实验步骤详解

1.细胞培养

细胞应在接近80%的培养密度时收集，以确保细胞的最佳生长状态和反应性。

2.染色过程

细胞接种：在96孔板中每孔接种约10^4个细胞。

染料添加：先向每孔加入Calcein-AM的工作液（通常终浓度为2 µM），孵育30分钟；随后添加PI（终浓度为4 µg/mL），继续孵育5-10分钟。

3.观察：在荧光显微镜下观察并拍摄，Calcein-AM发出绿色荧光，PI发出红色荧光。

 

洗涤步骤

使用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞两次，去除未结合的染料，减少背景信号。

 

四、结果观察与分析

1.显微镜下观察
使用荧光显微镜对染色后的细胞进行观察是评估染色效果的关键步骤。

调整显微镜的荧光滤光片，分别对Calcein-AM（绿色荧光）和PI（红色荧光）进行观察。

为获得最佳图像，应调整焦距和光强，确保能清楚地区分活细胞和死细胞。

活细胞显示明亮的绿色，而死亡或受损的细胞则显示红色。

2.数据记录与分析
图像捕捉后，使用图像处理软件，如ImageJ，进行进一步的分析。

首先，导入图像并使用软件的“测量”功能来计算绿色和红色信号的面积及强度，从而得出细胞的活死比例。

通过设定阈值分割活细胞和死细胞的信号，可以定量地评估药物处理或条件变化对细胞存活的影响。

 

五、常见问题及故障排除

问题诊断与解决方案

1.荧光信号弱

原因：荧光染料浓度过低或曝光时间不足。

解决方案：增加染料的浓度或延长曝光时间。同时检查荧光灯的强度是否足够。

2.细胞损伤

原因：染料孵育时间过长或操作过程中的物理损伤。解决方案：缩短染料的孵育时间，并在操作过程中尽量温和，避免强烈的吸吹或震动。

3.染色不均

原因：染料未能均匀混合或细胞密度过高。

解决方案：在添加染料前确保充分混合，并调整细胞密度以避免聚集。

 

Calcein-AM/PI双染法是一种快速、有效的细胞活性评估技术，它允许我们直观地观察细胞的存活和死亡。