按照无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒小量提取：

1.柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）。

2.取5-15ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，尽量吸除上清。

注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。

3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4.向离心管中加入500μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5.向离心管中加入500μl溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，然后室温放置10min左右，12,000rpm(~13,400×g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

注意：P4加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6.将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12,000rpm(~13,400×g)离心2min，滤液收集在干净的2ml离心管中（自备）。

7.向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇（加入异丙醇过多容易导致RNA污染），上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）。

注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP4的最大容积为700μl，所以需要分次过柱。

8.室温12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：将第7步中所得溶液分次过柱，每次均按以上条件操作。

9.向吸附柱CP4中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

10.向吸附柱CP4中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5min，有助于更好地去除杂质。

11.向吸附柱CP4中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液。

12.将吸附柱CP4重新放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

13.将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加

100-300μl洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心1min将质粒溶液收集到离心管中。

注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤12。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

质粒DNA浓度及纯度检测

得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。

电泳可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。

OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。

OD260/OD280比值应为1.7–1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。