一. 细胞膜简介
细胞膜是一种特殊生物膜，不仅保证了细胞内各种生理反应有序进行，也实现了物质、能量和信号的正常传导，其大部分功能依靠细胞膜上的膜蛋白完成。
膜蛋白提取的难点较多，主要原因是膜蛋白在生物体内的表达水平较低，具有极强的疏水特性，并且通常在实验条件下难以维持正确构象。
二. 细胞膜的结构
生物膜的特定功能主要是由蛋白质完成的；膜蛋白约占膜的40%～50%，有50余种膜蛋白；在不同细胞中膜蛋白的种类及含量有很大差异。
有的含量不到25%，有的达到75%；一般来说，功能越复杂的膜，其上的蛋白质含量越多。
三. 膜蛋白有哪些类型？
膜蛋白是膜功能的主要体现者。
根据与膜脂的结合方式以及在膜中的位置的不同，膜蛋白分为：整合蛋白（integralprotein）、外周蛋白（peripheralprotein）脂锚定蛋白（1ipid—anchoredprotein）。
整合蛋白（IntegraIProteins）部分或全部镶嵌在细胞膜中或内外两侧的蛋白质；根据跨膜次数将跨膜蛋白分为单次跨膜、多次跨膜、多亚单位跨膜等；整合蛋白约占膜蛋白的70一80%。
整合蛋白与膜结合非常紧密，只有用去垢剂（detergent）才能从膜上洗涤下来．常用SDS和Triton—X100。
外周蛋白又称为外在蛋白（extrinsicprotein），为水溶性的，分布在细胞膜的表面．靠离子键或其他较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子的亲水部分结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来。
脂锚定蛋白（Lipid—anchoredproteins）又称脂连接蛋白（1ipid—Iinke（1proteins）．同脂的结合有两种方式：一种方式是通过一个糖分子间接同脂双层中的脂结合；一种是蛋白质直接与脂双层中的脂结合。
脂锚定蛋白通过磷脂或脂肪酸锚定，共价结合。
分两类．一类是糖磷脂酰肌醇（GPl）连接的蛋白，GPl位于细胞膜的外小叶．用磷脂酶C处理能释放出结合的蛋白。许多细胞表面的受体、酶、细胞粘附分子和引起羊瘙痒病的PrPC就是这类蛋白。
另一类脂锚定蛋白与插入质膜内小叶的长哦氢链结合。
四. 常见的膜蛋白提取方法
1. 先分离膜，然后提取 如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。（例如：michael11 液氮研磨组织→加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂→差速离心→蔗糖密度梯度离心→收集 37% 与 41% 间的成分，即为质膜部分→裂解即可收集膜蛋白）。
2. 用特殊的去污剂选择性的分离 采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定。
去垢剂的选择通常是依据对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤。
虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂。
在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质。如 tritonX-100 在 280 nm 处有吸收，如果某蛋白质的测试与 280 nm 处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂。
将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来。
这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入。使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（＜ 5000 Da）要多。
一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足 0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的。
第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用 4 度时所有的蛋白质原则上都溶于 TritonX-114 水溶液，在温度超过 20 度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。
利用此性质可提取膜蛋白。
3. 膜蛋白色谱 （CMP）CMP+ 分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如 SDS）溶解膜蛋白后形成 SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。
羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS 结合量有关。
利用原子散射法研究 cAMP 的分离机制发现，样品与 SDS 结合后在离子交换柱上存在 SDS 分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。
4. 顺序抽提法根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。
用 Tris 碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的 pellet 用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。
5. 离心柱法提取膜蛋白高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心。GBCBIO/捷倍斯的膜蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒（G4422-1），可从哺乳动物培养细胞或组织中逐步分离和制备有活性的膜蛋白与胞浆蛋白，提取方法简单，可靠，快速，获得的膜蛋白纯度高，可用于SDS-PAGE电泳、Western Blot、免疫沉淀等后续实验，每次可以提取107个培养细胞或200mg动物组织。
• 多用途—适用于新鲜的哺乳动物细胞或组织样品，几乎没有交叉污染。
• 方便快捷—非变性，有活性的蛋白质可在90分钟内迅速提取完成。
• 兼容性好—提取的蛋白适用于多种下游实验，如Western Blot、免疫沉淀等。
膜蛋白抽提的操作步骤
1.准备细胞或组织样品：
A． 细胞
贴壁细胞：培养约2000-5000万细胞，用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。悬浮细胞：培养约2000-5000万细胞，直接离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。
B. 组织：
取约100毫克组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片
2．样品洗涤：用适量的已稀释的洗涤液洗涤样品三次，每次3000rpm离心2min。
3．样品裂解：在上述细胞或组织中加入1ml蛋白提取液（使用前加入PMSF，终浓度为1mM，与2.5μl DTT），4℃下用玻璃匀浆器手动上下手动匀浆30-50次。
或者用 超声波破碎细胞，每次30s，3-4次，每次间隔1分钟，置于冰上冷却。
细胞破碎后应经镜检，细胞破碎率不小于70%，无明显的组织块。
镜检：通常可以在匀浆30次后取约2-3微升细胞或组织匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环(A shiny ring around the nuclei)或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。
否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。
另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关，需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。
注：如果没有适当的玻璃匀浆器，对于培养的细胞也可以采用冻融法来破碎细胞。
把步骤2中的样品在液氮和室温依次反复冻融两次，然后取少量样品在显微镜下检测细胞破碎的程度。
如果细胞破碎的程度不足70%，可增加冻融次数，直到细胞破碎的程度大于70%。
4. 转移裂解液到预冷的1.5ml离心管中，冰上放置10分钟，期间剧烈涡旋2-3次，于4℃，16000rpm离心10min，弃沉淀，上清移至新的离心管中。
5.含上清的离心管37℃水浴10min，室温，13000rpm离心5分钟，样品分成上层与下层（含膜蛋白）。
建议使用进口的透明度高的离心管，方便观察分层，在分层交界处有一折光线，需仔细观察才可以见到。
6. 取下层，加入500ul冰冷灭菌水混匀，4℃放置5min后，置于37℃水浴10min。
7. 室温，13000rpm离心5分钟，样品分成上层与下层（含膜蛋白）。
8. 重复第6,7步操作一次，最终取下层即为膜蛋白提取物。BCA法测定蛋白浓度。
9. 每100ul膜蛋白提取物加入900ul预冷的丙酮，混匀冰浴20min，16000rpm离心15min。
10. 弃上清，沉淀真空干燥或敞盖冰浴10min，用含巯基乙醇或DTT适量的loading buffer溶解沉淀。如沉淀难以溶解，可以加入尿素或硫脲等强溶解力试剂。
