一、实验材料
在开始实验前，准备好所有所需的试剂和产品，通常包括：
1.荧光抗体
2.染色缓冲液
3.红细胞裂解液（Lysis buffers）
4.固定缓冲液(Fixation buffers)
5.破膜缓冲液（Permeabilization buffers）
6.活性染料
技巧和窍门（Tips and Tricks）：
1.在使用任何产品之前，请务必检查有效期。
2.将活性染料和核酸染料分装成单次使用量，防止反复冻融。
二、滴定
为了获得最佳分辨率，通过进行抗体滴定，确定实验中特定细胞的最佳染色浓度。
技巧和窍门：注意样本体积，以避免上机采集时收空。
三、细胞制备方法
为确保实验性能，使用适当的细胞制备方法很重要：
低频细胞分析可能需要进行分离和富集步骤。
细胞激活。
使用蛋白质运输抑制剂来在细胞内捕获细胞因子/蛋白质。
注意孵育时间以避免毒性。
冻存和培养的细胞以及组织来源的细胞通常含有许多死细胞，这些细胞可能会表现出不寻常的自发荧光和非特异性染色。
1）使用细胞筛网过滤可以去除细胞团块，以防止高背景染色或仪器堵塞。
2）通过维持细胞在适当的温度，可以防止进一步的细胞死亡。
3）使用活性标记来排除死细胞可以改善您的分析。
技巧和窍门：冻存细胞在冷冻和解冻过程中会经历压力。将细胞在培养中休息可能有助于恢复其表面表型或生物学功能。
四、对照设置
对照是流式细胞术实验中不可或缺的部分，它们帮助确保数据的准确性和可靠性。
五、多色方案染色
为了获得最佳性能，请确保：
1.染色全程避光，并在染色后2-3次洗涤样本以最小化背景。
2.遵守孵育时间和温度要求
六、样本采集
补偿是流式细胞术工作流程中的关键步骤，因为它可以帮助纠正荧光素溢出。
1.对仪器进行质量控制并设置参数，以确保最佳和一致的检测性能。
2.在获取单染对照或样本之前，确保所有阳性信号都在刻度内。
3.采集单染对照并计算补偿。
4.确定记录足够的事件数量，以对感兴趣的细胞进行稳健的分析。
5.确保在样本之间保持采集速度恒定。
6.采集样本后记得清洁您的仪器。
技巧和窍门：在获取补偿对照或计算补偿后，不能更改荧光PMT（光电倍增管）电压，否则需要重新采集单染数据，重新计算补偿。
