一、试剂耗材准备

可用于荧光实验的一抗、荧光二抗、4%多聚甲醛、曲拉通（破膜剂）、BSA或二抗来源动物的血清，一般是山羊血清（用于封闭）、PBS、DAPI和抗荧光淬灭封片剂（可选用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂）、盖玻片或专用细胞爬片、载玻片等。

二、细胞爬片准备

爬片可以用一般的盖玻片，也可以用专用细胞爬片，目前还有共聚焦小皿可供选择。

共聚焦培养皿常用规格：

圆形（φ24mm、φ20mm、φ14mm、φ8mm）。分别对应6孔板配套用细胞爬片、12孔板配套用细胞爬片、24孔板配套用细胞爬片、48孔板配套用细胞爬片。

具体的根据实验需要进行选择。

1.爬片的使用前处理：将剪裁好的爬片或购买的成品爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天用自来水冲洗干净并置于消毒饭盒中，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不要接触纱布。然后高压蒸汽灭菌，置于烘箱中烘干。

注：若使用共聚焦小皿则无需前处理操作，直接在超净台打开包装，拿出培养皿，加入细胞悬液，盖上皿盖，置于培养箱中培养即可。

2.原代细胞或贴壁不牢的细胞爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片增加细胞粘附性，以防后面用PBS洗片的时候将细胞洗掉。用以上促细胞贴壁溶液处理玻片后，放到培养基之前用培养基冲洗1-3遍。

三、爬片

1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞前，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴100ul培养基，使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。(整个过程注意无菌操作)

3.根据实验需要及细胞生长情况选择合适的细胞密度接入培养板内。

4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片（通常作用24h）。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。未取出的可接着继续培养。

四、固定

可以将爬片取出用PBS清洗后固定，也可以直接在孔板中清洗并固定。

共聚焦小皿则直接移除培养基加入PBS清洗1-3次即可，清洗时注意不可剧烈摇晃，清洗完成后加入一定体积的4%多聚甲醛进行固定。

通常为室温（RT）固定15-20min。

五、通透

固定结束后用预冷的PBS洗三次，同样不要太用力。

并不是所有的染色都需要通透，这个步骤取决于你的抗体是不是胞内蛋白，若是膜蛋白则不需要这个步骤。

常用的透化剂是0.1% Triton X-100(买回来的成品是100%的，用PBS稀释到对应比例即可)作用10min，文献中也有用0.2%或0.5%Triton X-100的，具体可根据预实验进行调整。

六、封闭

BSA的浓度只要1或5%（PBS溶解）就可以，血清只要10%即可。RT封闭30min。如果你的一抗结合力很强或者二抗有非特异性结合，那么可以添加0.1%Tween20。

七、一抗孵育

封闭结束后，PBS清洗3遍后孵育一抗，一抗可用封闭液稀释，也可以用PBS或抗体稀释液，4℃孵育过夜。一抗稀释比例可参照抗体说明书，建议从推荐比例中间开始试。

八、二抗孵育

次日吸走一抗（可回收）后，用PBS清洗3遍，每次5-10min,然后避光孵育二抗1h。

九、DAPI染色

去除二抗，用PBS清洗三次，加入DAPI，室温静置5min,去除DAPI，PBS洗3次。

十、封片

向载玻片上加入一滴封片剂，将盖玻片缓慢扣在载玻片上，细胞所在面靠近载玻片，用吸水纸吸除多余封片剂。