免疫组化样本固定与制片的实用指南主要涉及样本的固定、包埋、切片、脱蜡水化以及后续的处理步骤。以下是一个详细的指南：

一、样本固定

1.目的：确保组织样本的质量和完整性，为后续实验打下坚实基础。

2.步骤：

取材：从动物或人体取得所需的组织样本，确保组织块大小适中，以便于固定液能够充分渗透。

冲洗：如果组织样本带有血液或其他体液，应先用生理盐水或PBS进行冲洗，以去除可能影响固定效果的物质。

固定：

固定液选择：常用的固定液有4%多聚甲醛溶液（或10%中性缓冲福尔马林），冰冻切片/神经组织可以使用OCT包埋剂。

固定时间：根据组织类型和实验要求而定，一般固定时间为室温18-24小时，但不宜过长，以免导致组织过度硬化和抗原性的丧失。

固定液量：固定液的量通常为组织体积的10-20倍，以确保组织能够充分浸入固定液中。大组织标本应切开固定，以免中间部分自溶解腐败。

注意事项：固定的温度通常为室温或4°C，避免高温导致组织损伤；在固定过程中，要确保组织样本完全浸入固定液中，避免出现未固定的部分；固定的容器应干净、无杂质，避免对组织造成污染。

二、包埋

1.目的：保护和支撑组织样本，以便在切片时保持其完整性。

2.步骤：

脱水：通过酒精梯度脱水，去除组织样本中的水分，以便于包埋介质能够充分渗透。

透明：使用透明剂（如二甲苯）去除组织样本中的酒精和其他溶剂，使组织样本变得透明。

浸蜡：将脱水透明的组织样本置于熔化的石蜡中，使石蜡均匀渗透。

包埋：将浸蜡后的组织样本放入模具中，倒入熔化的石蜡，然后让石蜡冷却凝固。

三、切片

1.目的：将包埋后的组织样本切割成薄片，以便于在显微镜下观察和检测。

2.步骤：

切片前的准备：确保包埋后的组织块已经充分冷却并固化。

切片：将包埋好的组织块固定在切片机的样本夹上，调整切片机的切片厚度（通常为4-5微米厚），进行切片。

展片：使用刷子或毛笔轻轻地将切好的组织切片从刀上取下，并放在温水（40℃）中展开。

烤片：将展好的切片粘附在载玻片上，并进行烘烤（如60℃烤片2小时），使切片牢固地附贴在载玻片上。

四、脱蜡水化

1.目的：将组织切片从石蜡中释放出来，并使其恢复到适合进行后续抗原检测和染色的状态。

2.步骤：

脱蜡：将切片置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蜡。

水化：通过梯度乙醇处理切片，去除组织中的二甲苯，并使组织恢复到水合状态。

五、后续处理

1.抗原修复：通过修复过程暴露被固定时隐藏的抗原表位，提高抗体的结合效率。常用的修复方法有微波热修复、水浴热修复、高压热修复和酶解修复等。

2.内源性酶灭活：消除细胞或组织中内源性酶和活性物质的影响，降低背景噪音，提高实验的特异性和敏感性。

3.封闭：封闭组织切片上非特异性结合位点，防止抗体与这些位点结合，从而减少背景信号。

4.一抗孵育：特异性识别目标抗原，为后续的检测提供准确标记。

5.二抗孵育、显色、复染、封片观察：按照实验流程进行后续操作，最终在显微镜下观察显色部位并进行分析。

六、注意事项

1.在整个实验过程中，要注意操作规范和实验条件的控制，以确保实验结果的准确性和可靠性。

2.样本固定、包埋、切片和脱蜡水化等步骤是免疫组化实验的基础和关键，必须严格按照实验流程进行操作。

3.在实验过程中遇到问题时，要及时查找原因并采取相应的解决措施，以确保实验的顺利进行。