RT-qPCR（Quantitative Reverse Transcription PCR，即定量逆转录PCR）是一种常用于基因表达分析、RNA干扰验证、病原体检测等分子生物学应用的实验方法。在RT-qPCR中，RNA首先通过逆转录酶转录成cDNA，随后以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR可以通过一步法或两步法来完成，
这两种方法各有其优缺点。
一、一步法RT-qPCR
实验过程：
一步法RT-qPCR将逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内、同样缓冲液条件下完成反应。这种方法简化了实验步骤，减少了实验误差和污染风险。
1.优点：
减少实验误差：由于两步反应都在一个管中完成，减少了因操作不当或样品转移带来的误差。
操作简便：加样环节少，更少的移液步骤能够降低污染的风险。
高通量扩增：适用于高通量扩增/筛选，快速且可重现性高。
2.缺点：
无法分别优化：无法分别对逆转录和PCR扩增两步反应进行优化，可能导致灵敏性较低。
灵敏性不足：由于反应条件是结合两步反应折中得到的，灵敏性可能不如两步法。
单一样品检测靶点数少：由于操作限制，单一样品检测的靶点数可能较少。
上下游引物易二聚：在特定温度下，上下游引物易发生二聚体聚合，导致非特异扩增。
二、两步法RT-qPCR
实验过程：
两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件以及引物设计策略。首先用逆转录酶合成cDNA，然后以cDNA为模板进行qPCR扩增。
1.优点：
优化灵活性：能够分别优化逆转录和PCR扩增的反应条件，提高灵敏性和特异性。
cDNA库稳定性：中间产物cDNA能够建立可以长期保存、并用于多次反应的稳定的cDNA库。
多靶标扩增：通过oligo dT和随机引物，可以从单个RNA样本中扩增多个靶标，而不需要多重cDNA库。
试验成本低：相较于一步法，可能在某些情况下具有成本优势。
2.缺点：
污染风险增加：使用多个试管和更多的移液步骤可能会增加DNA污染的风险。
耗时较长：分步操作耗时较长，且需要多次加样移液。
需要更多优化：相较于一步法，需要进行更多的优化工作。
综上所述，一步法RT-qPCR和两步法RT-qPCR各有其适用场景和优缺点。在选择时，需要根据实验的具体需求、样本量、灵敏度要求以及实验条件等因素进行综合考虑。
