全蛋白的提取方法和注意事项是实验过程中的关键环节，它们直接影响到后续实验结果的准确性和可靠性。以下将详细阐述全蛋白的提取方法以及需要注意的事项。

一、全蛋白的提取方法

全蛋白的提取方法多种多样，根据样本来源的不同，提取方法也有所差异。

以下是一些常见的全蛋白提取方法：

1.单层贴壁细胞总蛋白的提取：

   倒掉培养液，用预冷的PBS洗涤细胞三次，以去除培养液中的杂质。

   加入含有蛋白酶抑制剂（如PMSF）的裂解液，冰上裂解一定时间（如30分钟），期间可轻轻摇动培养瓶以促进裂解。

   使用刮棒将细胞刮下，并将细胞碎片和裂解液移至离心管中。

   离心后取上清，即为总蛋白溶液，可进行后续的分装和保存。

2.组织中总蛋白的提取：

   将组织块置于匀浆器中，用剪刀剪碎后加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液进行匀浆。

   匀浆后的样品置于冰上裂解一段时间（如30分钟），期间可多次碾磨以充分裂解组织。

   离心后取上清，即为组织总蛋白溶液。

3.细胞培养上清中总蛋白的提取：

   将培养液收集后，通过离心去除细胞碎片和其他杂质。

   取上清液，加入适量的浓缩剂或沉淀剂，使蛋白沉淀。

   离心后取沉淀，加入适量的裂解液溶解，即为培养上清中的总蛋白溶液。

4.其他方法：

   根据实验需要，还可以采用其他方法如超声破碎、高压破碎等物理方法辅助裂解细胞或组织。

   此外，还有一些商业化的蛋白提取试剂盒可供选择，这些试剂盒通常包含优化的裂解液和操作步骤，能够简化实验流程并提高提取效率。

二、注意事项

在进行全蛋白提取时，需要注意以下几点以确保实验结果的准确性和可靠性：

1.低温操作：整个提取过程应尽量在低温下进行（如4℃），以防止蛋白的降解和变性。

2.蛋白酶抑制剂：在裂解液中加入适量的蛋白酶抑制剂（如PMSF）以防止蛋白在提取过程中被降解。

3.避免反复冻融：提取后的蛋白应尽快进行后续实验或分装后保存于低温冰箱中（如-80℃），避免反复冻融对蛋白的影响。

4.控制pH值和离子强度：裂解液的pH值和离子强度对蛋白的提取效率有很大影响，应根据实验需要选择合适的裂解液配方。

5.充分裂解：确保细胞或组织被充分裂解以释放蛋白是提取成功的关键步骤之一。可以通过调整裂解时间、裂解液用量以及物理辅助方法（如超声破碎）来优化裂解效果。

6.去除杂质：在提取过程中应尽量避免核酸、多糖和脂类等杂质的污染以免影响实验结果。可以通过离心、过滤等方法去除这些杂质。

7.蛋白定量：提取后的蛋白应进行定量以确定其浓度和纯度，为后续实验提供准确的参考数据。常用的蛋白定量方法包括BCA法、Bradford法等。

三、保存方法

1.短期保存（1周内）：

   温度：大多数蛋白质可以保存在4℃。

   防止污染：如果保存时间超过24小时，建议使用0.22 µm的滤膜过滤样品，除菌后保存在无菌的管子中。

2.长期保存：

   冷冻保存：将蛋白样品分装后，快速冷冻在液氮或干冰/乙醇混合物中，然后转移到-20℃或-80℃保存。

   添加保护剂：在保存过程中，可以添加10%-50%的甘油以防止蛋白质冻融损伤。

3.冻干保存：

   方法：将蛋白质溶解在挥发性缓冲液中（如三甲胺/ HCl，pH 6.8-8.8），然后进行冻干处理。

注意事项：并非所有蛋白质都适合冻干保存，某些蛋白质在冻干过程中可能会失去活性。