一、软骨细胞传代培养指南
1.材料准备
培养基：通常使用DMEM/F12培养基，加入10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1%L-谷氨酰胺，并进行过滤消毒。
消化液：常用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液。
培养瓶/皿：根据实验需求选择适当大小的培养瓶或培养皿。
其他器材：无菌吸管、离心管、显微镜、CO2培养箱等。
2.传代步骤
细胞生长观察：当细胞生长至80%-90%融合时，即可进行传代培养。
弃去旧培养基：用无菌吸管吸去旧培养基，避免对细胞造成损伤。
清洗细胞：用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次，以去除残留的培养基和死细胞。
消化细胞：加入适量的消化液，覆盖瓶底，置于37℃培养箱中消化1-2分钟。在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，即可终止消化。
收集细胞：加入含血清的培养基终止消化，用无菌吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱落。将细胞悬液转移至离心管中，离心后弃去上清液。
重悬细胞：加入适量的新鲜培养基重悬细胞，并调整细胞密度至适宜浓度。
接种细胞：将细胞悬液接种至新的培养瓶或培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。
3.培养条件
温度：37℃。
CO2浓度：5%。
湿度：饱和湿度。
换液频率：根据细胞生长情况而定，一般每2-3天更换一次培养基。
二、软骨细胞传代培养注意事项
1.无菌操作
在整个传代培养过程中，必须严格遵守无菌操作规程，避免细胞污染。
所有实验器材和材料都应提前进行高压灭菌处理，并在超净台内进行操作。
2.细胞密度控制
接种时细胞密度要适度，不可过高或过低。过高的细胞密度会导致细胞生长缓慢或死亡，过低的细胞密度则会影响细胞的贴壁和增殖。
一般建议接种密度为2×104/cm²。
3.消化时间控制
消化时间不宜过长或过短。过长的消化时间会导致细胞损伤或死亡，过短的消化时间则无法使细胞完全脱落。
消化过程中应在显微镜下密切观察细胞形态变化，以确定最佳消化时间。
4.培养基选择
选择适合软骨细胞生长的培养基，并根据实验需求添加适当的生长因子和添加剂。
培养基应定期更换，以保持其营养成分的稳定性和有效性。
5.细胞状态观察
定期在显微镜下观察细胞形态和生长情况，及时发现并处理异常现象。
若发现细胞生长缓慢、形态异常或污染等情况，应及时采取措施进行处理。
6.传代频率
根据细胞生长情况和实验需求确定传代频率。传代过于频繁会影响细胞的生长和增殖能力，传代间隔过长则会导致细胞老化或死亡。
7.细胞冻存与复苏
对于需要长期保存的软骨细胞，可以进行冻存处理。冻存时应选择适当的冻存液和冻存条件，以确保细胞的存活率和活性。
复苏时应快速解冻细胞，并在复苏后尽快进行传代培养，以减少细胞损伤和死亡。
