一、实验前准备

1.样本选择

样本类型：CosMx SMI技术适用于多种组织样本类型，但不同组织样本在RNA信号和基因检出情况上存在差异。因此，在选择样本时，需要充分考虑样本的组织类型、疾病状态等因素。

样本质量：组织块和切片质量是影响数据质量的主要因素。高质量的样本能够提供更准确、可靠的实验结果。因此，在实验前需要对样本进行严格的质量控制，确保样本的完整性和纯度。

2.实验条件优化

载玻片制备：参阅《CosMx 载玻片制备手册》和《样品切片技巧和窍门》来获得高质量的样本。

实验条件调整：官方总结了各种组织类型，并建议对实验条件进行修改，以优化数据质量。例如，对于不同类型的组织样本，可能需要调整PCR扩增条件、杂交温度等参数。

二、实验过程

1.样本制备

裂红处理：如果原样品中存在红细胞，需要先进行裂红处理，以避免红细胞RNA对实验结果的干扰。但需注意裂解时间，避免对其他细胞造成损伤。

细胞计数与矫正：流式分选的细胞计数值可能会比真实细胞总量偏高（20-80%），需要使用计数仪或镜检进行计数矫正。

单细胞悬液制备：最终的单细胞悬液需符合上机要求，包括镜检背景干净、细胞活率大于80%、细胞结团率小于10%、细胞总数大于1×10^6个、细胞浓度在700-1500个/μl之间。

2.实验操作

仪器运行：仪器运行时间取决于所检测的组织面积（FOV数量）。针对不同的基因检测panel（如人6k、人1k、小鼠1k、64蛋白等），需要最大限度地增大扫描区域，以获得最优的基因检出效率。

数据分析：CosMx SMI实验产生的数据量大、复杂度高，需要使用专业的软件进行数据分析和可视化。例如，利用先进的细胞分割算法结合组织形态学染色来提高细胞分割精度，从而更准确地获取单细胞级别的转录组信息。

三、实验后验证

1.数据比对

样本验证：将实验数据与已知的标准样本数据进行比对，验证实验结果的准确性和可靠性。

交叉验证：如果可能的话，使用不同的方法或技术对同一样本进行检测，以验证实验结果的重复性。

2.结果解读

细胞类型鉴定：利用CosMx SMI技术可以鉴定出不同的细胞类型，并进一步分析它们的空间分布和转录组特征。

基因表达分析：通过分析单细胞级别的转录组数据，可以揭示基因在不同细胞类型中的表达差异和空间分布规律。

生物学意义解读：结合实验结果和生物学背景知识，深入探讨实验结果的生物学意义和应用价值。

四、实验注意事项

1.实验条件的一致性：确保实验过程中使用的试剂、仪器等条件的一致性，以减少实验误差。

2.样本的保存与处理：在样本的采集、运输和保存过程中，需要遵循严格的规范，以确保样本的质量和稳定性。

3.数据的备份与存储：实验产生的大量数据需要及时备份和存储，以防止数据丢失或损坏。

五、实验优势与应用前景

1.高分辨率的空间信息：CosMx SMI技术能够在亚细胞水平上提供高分辨率的空间信息，有助于揭示细胞间的相互作用和微环境的空间异质性。

2.单细胞级别的转录组数据：该技术能够获取单细胞级别的转录组数据，为深入研究细胞异质性和基因表达调控机制提供了有力支持。

3.广泛的应用前景：CosMx SMI技术在肿瘤免疫、神经科学、发育生物学等领域具有广泛的应用前景，有望为相关疾病的研究和治疗提供新的思路和方法。