环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）技术原理浅析

环介导等温扩增（LAMP）是一种由T. Notomi等人在2000年研发的新型核酸扩增技术。它能够在恒温条件下，通过链置换DNA聚合酶（如Bst DNA聚合酶）实现DNA片段的高效、快速扩增，从而广泛应用于基因检测领域。本文将详细解析LAMP技术的原理及其扩增过程。

一、LAMP技术的基本原理

LAMP技术的基本原理是利用4条或6条特异性引物，针对靶基因的6个特定区域进行设计，在链置换DNA聚合酶的作用下，于60-65℃的恒温条件下进行核酸扩增。这一温度范围是双链DNA复性及延伸的中间温度，使得DNA在此温度下处于动态平衡状态，便于链置换反应的发生。

二、LAMP技术的引物设计

LAMP技术的引物设计是其成功的关键。通常需要设计4条引物，包括两条内引物（FIP和BIP）和两条外引物（F3和B3）。在某些情况下，还可以设计额外的环引物（Loop F和Loop B）以提高扩增效率。

1.正向内引物（FIP）：由F2和F1c区域组成，F2区域与靶基因3’端的F2c区域互补，F1c区域与靶基因5’端的F1c区域序列相同。

2.正向外引物（F3）：由F3区域组成，与靶基因的F3c区域互补。

3.反向内引物（BIP）：由B1c和B2区域组成，B2区域与靶基因3’端的B2c区域互补，B1c区域与靶基因5’端的B1c区域序列相同。

4.反向外引物（B3）：由B3区域组成，与靶基因的B3c区域互补。

引物设计的复杂性使得LAMP技术具有很高的特异性，任何一个区域的引物不匹配都会导致扩增失败。

三、LAMP技术的扩增过程

LAMP技术的扩增过程可以分为复制起始阶段和循环扩增阶段。

1.复制起始阶段：

正向内引物FIP的3’端F2序列与靶DNA的F2c区域结合，引导DNA合成。

正向外引物F3比FIP短，缓慢地与模板中的F3c互补配对，并启动链置换DNA合成，置换出正向内引物FIP引导的合成链。被置换出的DNA单链（片段A）由于5’端含有F1c和F1序列，可互补配对形成茎环结构。

置换出来的单链DNA的3’端B2c区域可与反向内引物BIP的B2序列结合引导DNA合成。然后反向外引物B3与3’端B3c互补配对，并置换出反向内引物BIP合成的DNA单链。最终被置换出来的DNA单链5’端和3’端均含有可自身互补配对成环的序列（B1c/B1和F1c/F1），形成茎环结构（片段B）。

2.循环扩增阶段：

片段B的3’端形成环状结构后，可以以自身序列为模板引导DNA链合成。同时，3’端环状部分的F2c区域为单链状态，可与正向内引物FIP的F2序列结合引导DNA合成。

新合成的DNA单链3’端含有B1/B1c序列，可再次互补配对成环，并且3’端又可以自身序列为模板引导DNA链合成，同时置换出前面合成的DNA链。

如此往复循环，形成一系列交替反向重复靶序列构成的不同个数茎环结构、多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。

四、LAMP技术的优势与应用

LAMP技术相比传统PCR技术具有诸多优势，包括操作简便、反应快速、特异性强、灵敏度高、设备要求低、结果易于检测等。这些优势使得LAMP技术在病原微生物检测、传染性疾病诊断、环境监测、食品安全等领域得到了广泛应用。

1.操作简便：LAMP反应不需要复杂的温度循环控制，只需一个简单的恒温装置即可完成反应。

2.反应快速：LAMP反应可在15-60分钟内实现10^9～10^10倍的核酸扩增。

3.特异性强：LAMP技术使用多条引物，对靶基因具有高度选择性，减少了非靶标序列的影响。

4.灵敏度高：LAMP技术能够检测到极低浓度的靶基因。

5.设备要求低：LAMP反应不需要昂贵的PCR仪，只需一个简单的恒温装置即可。

6.结果易于检测：LAMP反应产物可通过电泳、浊度法或染料法进行检测，其中染料法最为常用，可实现实时检测。

五、结论

LAMP技术作为一种新型的核酸扩增技术，以其操作简便、反应快速、特异性强、灵敏度高、设备要求低、结果易于检测等优势，在基因检测领域展现出了广阔的应用前景。随着技术的不断发展和完善，LAMP技术将在更多领域发挥重要作用。