一、实验准备

1.实验材料：

DMEM高糖培养基、FBS/NBS HT选择培养基

CO₂细胞培养箱、细胞计数器、单通道移液枪、多通道移液枪

相差显微镜、生物安全柜、各种规格的吸头（10μL、200μL、1000μL）

96孔、24孔、6孔细胞培养板，15mL、50mL无菌离心管，100mm细胞培养皿，T75细胞培养瓶

Elisa检测板、封闭液、1×PBST洗液、抗原、二抗、显色底物等

2.对照设置：

阳性对照：融合前采集对应实验的小鼠眼球血，经过处理后取上清，-20℃条件下保存。使用前提前解冻，稀释1000倍备用。

阴性对照：留取各个阶段的培养基约5mL，作为阴性对照。

3.Elisa检测板准备：

将对应抗原用缓冲液稀释至1μg/mL，加入96孔酶标板内（100μL/孔），4℃过夜静置包被。

用1×PBST洗板2遍，加入封闭液，37℃封闭1小时。

再次用1×PBST洗板2遍，拍干水分，4℃短期保存或-20℃长期保存。

 

二、细胞融合与检测

1.细胞融合：

将准备好的同系骨髓瘤细胞（如SP2/0）与小鼠脾细胞按一定比例（如1:2至1:10）混合，离心去除培养基。

缓慢加入化学促融合剂（如聚乙二醇PEG），制备可稳定遗传的杂交瘤细胞。

2.融合检测：

细胞融合换液后，等待4至7天，观察细胞融合状态。当大部分细胞培养孔内出现小细胞团时，即可开始检测。

用排枪取融合培养上清100μL/孔，加入包被好的Elisa检测板中。注意从细胞培养板中单次取液，不可反复吸取，防止污染。

根据阴性对照和阳性对照的OD值，确定阳性孔。通常，取阳性对照OD值一半以上的数值为阳性。

 

三、亚克隆与筛选

1.第一次亚克隆：

根据融合检测的数据，挑选阳性孔，将阳性孔中的细胞转移至24孔板中培养扩增。

根据细胞生长情况，2至3天后采用Elisa方法复检，防止假阳性。

挑选复检阳性的孔，进行细胞复悬和计数。根据计数情况比例稀释细胞悬液，按照1个/孔的密度均匀铺于96孔细胞培养板中，一个阳性克隆株铺一块细胞培养板。

一次亚克隆采用FBS-DMEM（HT）培养基，血清使用浓度略低于融合时的浓度，略高于SP2/0常规培养浓度（如5%）。

2.画克隆与检测：

一次亚克隆后，融合细胞在CO₂培养箱中培养4至5天。采用相差显微镜逐孔观察，在单孔内有且只有一个正圆形细胞团的孔，即为单克隆细胞孔，做好标记。

若无单克隆孔，则挑选细胞团较少的多克隆细胞孔进行标记。

画克隆后，继续培养3至5天，采用Elisa法进行一次亚克隆检测。优选挑选阳性单克隆孔，若无阳性单克隆孔，则挑选克隆数较少的阳性多克隆孔。

挑选出来的细胞株转移至24孔板中扩增培养，进行阳性克隆株复筛，确保挑选的细胞株非假阳性。

3.第二次亚克隆：

将一次亚克隆挑选出来的细胞株，重复一次亚克隆步骤。细胞培养基换成FBS-DMEM，血清使用浓度调整成SP2/0的常规培养浓度。

二次亚克隆后4至5天，进行画克隆，单克隆孔做好标记。

画克隆后，继续培养3至5天，重复一次亚克隆检测步骤，挑选阳性单克隆细胞株，准备进行扩增培养。

 

四、建株与鉴定

1.建株：

阳性单克隆细胞株需进行至少2次的亚克隆，检测为全阳方可建株。若为了保证稳定性，建议进行第三次亚克隆。

挑出两次检测均为单克隆且全为阳性后，在24孔板中培养扩增。2至3天后用Elisa法进行交叉检测（主要针对带标签的蛋白抗原）和稳定性鉴定。

2.鉴定与扩增：

检测合格后，挑选一个细胞状态良好、长势较好且阳性OD值较高的细胞株，转移至6孔板进行培养扩增。

2至3天后，用亚型检测试剂盒进行抗体亚型鉴定。

完成以上鉴定后，将单克隆细胞株转移至100mm细胞培养皿或T75细胞培养瓶中进行大量扩增。

 

五、细胞冻存与保存

1.细胞冻存：

扩增完成后，将单克隆细胞株进行细胞冻存。标记好细胞名称、冻存者、冻存日期等信息。

冻存时，将细胞悬液与含有DMSO的冻存液混合，转移至冻存管中。放置冻存盒中，转移到-80℃冰箱保存。一天后，转移至液氮罐中长期储存。

细胞冻存应至少保存3支/株，且确保有2个及以上冻存批次，以避免出现冻存失误导致细胞株丢失。

2.复苏检测：

冻存后一周，对细胞株进行复苏检测，防止细胞株出现产抗不稳定现象。

若检测没有问题，则将细胞株录入细胞库中，并撰写实验报告。

 

六、注意事项

1.无菌操作：整个实验过程应在无菌条件下进行，防止微生物污染。

2.细胞状态：密切关注细胞的生长状态，及时调整培养条件。

3.试剂质量：使用高质量的试剂和培养基，确保实验结果的可靠性。

4.实验记录：详细记录实验过程中的每一步操作和数据，为后续研究提供参考。