A1.高效液相色谱及高效液相的分离原理是什么呢？

Q1 .高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC，又称为“高压液相色谱和高分离度液相色谱等”）是一项重要的分析分离技术，用于分离和鉴定混合物中的多种组分，并对各种组分进行定量分析。 HPLC采用高压输送系统，将含有样品溶液的不同极性的（单一或不同比例混合）溶剂和流动相泵入填充有固定吸附材料的色谱柱中。样品中不同组分在两相中具有不同的分配系数，在色谱柱中做相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，使不同组分在移动速度上产生较大差别，从而实现分离。

 

Q2为什么色谱峰会出现拖尾？

A2

1. 样品溶剂极性过强——解决办法：确保样品溶剂极性低于或者等同于流动相极性；

2. 色谱柱超载——解决办法：减少进样体积或减小进样浓度；

3. 筛板堵塞或柱失效——解决办法：反向冲洗色谱柱，替换筛板或更换色谱柱；

4. 存在干扰峰——解决办法：使用更长的色谱柱，或更换流动相，或更换选择性更好的色谱柱；

5. 色谱柱塌陷、污染等色谱柱本身的问题——解决办法：更换色谱柱。

 

Q3为什么色谱峰出现双峰或分叉？

A3色谱双峰指的是一种物质在一张色谱图中出现两个峰。

这种情况可能由于：

1. 溶剂极性及进样量——解决办法：当溶剂的极性与流动相的极性相差非常大也可能出现双峰，将进样量减少一半以上；当进样量不大，但是浓度很大时，则考虑是色谱柱过载，将样品稀释后再进样；

2. 样品体积过大——解决办法：用流动相配样，总的样品体积小于第一峰的15%；

3. 流动相比例不合适——解决办法：调节有机相比例；

4. 样品溶剂极性过强——解决办法：采用较弱的样品溶剂；

5. 样品的特性——解决办法：动态平衡的互变异构现象，如红霉素；

6. 色谱柱——解决办法：原色谱峰出现双峰且一大一小，可以判断色谱柱柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或用酸洗或其他试剂；

7. 柱塌陷或形成短路通道——解决办法：更换色谱柱，采用较弱腐蚀性条件；

8. 柱内烧结不锈钢失效——解决办法：更换烧结不锈钢，加在线过滤器，过滤样品。

 

Q4为什么色谱图中出现“鬼峰”？

A4当色谱图上出现比较杂乱且诡异的峰时我们称它为“鬼峰”。

这种情况可能由于：

1. 上次进样的残留——解决办法：用强溶剂冲洗色谱柱，并用初始流动相平衡色谱柱30 min及以上；

2. 溶剂中有气泡——解决办法：溶剂脱气；

3. 样本中存在不明干扰物——解决办法：样本净化或预分离；

4. 色谱柱未平衡——解决办法：重新平衡色谱柱，用流动相作样品溶剂（尤其是离子对色谱）；

5. （TFA）氧化——解决办法：每天新配，用抗氧化剂；

6. 溶剂污染——解决办法：使用新配制的HPLC级溶剂，梯度方法常表现为“鬼峰”。

 

Q5为什么色谱峰峰型展宽，变成“矮胖型”？

A5色谱图在正常的情况下是“瘦高型”的，变成“矮胖型”是色谱峰峰型展宽导致。

这种情况可能由于：

1. 柱子没有平衡好——解决办法：用流动相重新平衡色谱柱；

2. 样本溶剂极性过强——解决办法：确保样品溶剂低于或者等同于流动相的强度；

3. 进样量过大——解决办法：减少进样体积，避免样品过载；

4. 进样浓度过大——解决办法：减少进样浓度，避免样品过载；

5. 流动相比例不合适——解决办法：调节有机相比例；

6. 温度波动——解决办法：使用恒温控制的柱温箱，温度越高峰形越尖锐；

7. 流动相粘度太高——解决办法：增加柱温；

8. 保留时间长——解决办法：用梯度洗脱或更强的流动相；更换短的色谱柱；

9. 色谱柱塌陷——解决办法：更换新的色谱柱；

10. 检测器时间常数慢——解决办法：调节时间常数使之与峰宽匹配。

 

Q6为什么色谱图中出现倒峰？

A6

1. 常为溶剂峰，样本的溶剂的极性和光吸收度与流动相相差很大，而进样量又较大的话，样本的溶剂不能和流动相充分混合均匀，溶剂被洗脱形成一个峰，如果溶剂的紫外吸收比流动相小，就会出现负峰；或流动相加了有一定紫外吸收的添加剂，而样品中含有无紫外吸收的无机盐或其它物质时，也会出现负峰——解决办法：用流动相作为样本溶剂，使用高纯度的溶剂作为流动相；

2. 折光检测器：溶质折射率小于溶剂折射率——解决办法：无误；将极性调反使之为正；

3. 样品中的杂质没有紫外处吸收或吸收很小，而流动相紫外吸收大时，如用甲醇时波长设定在220nm以下时，常出现这种现象；

4. 进样过程中进入了空气也会导致的。

 

Q7用液相测定多种物质时，怎样可以使色谱图中的色谱峰位发生重排呢？

A7在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的保留时间，不会发生峰位的重排。

以下条件的改变可能发生峰位重排：

1. 流动相中换了强溶剂；

2. PH值的改变；

3. 色谱柱填料的改变；

4. 柱温的改变；

5. 流动相的组成改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）。

 

看了这么久是不是都快忘记正常的色谱峰型长什么样子啦，来一个经典峰型给大家养养眼：