一、实验准备
1.材料准备：
细胞：选择符合实验要求的细胞，如经免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞（如SP2/0细胞）。
培养基：DMEM高糖培养基、HAT（次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷）或HT（次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷）选择培养基、FBS（胎牛血清）等。
试剂：50%聚乙二醇（PEG）溶液（常用分子量为4000的PEG）、双抗（青链霉素混合液）等。
器具：生物安全柜、灭菌手术剪刀、镊子、5mL一次性无菌注射器、单通道或多通道移液枪、低速离心机、倒置相差显微镜、无菌离心管、96孔细胞培养板、细胞培养皿、吸头等。
2.细胞准备：
饲养细胞制备：提前一天制备饲养细胞，常用小鼠腹腔巨噬细胞或脾细胞，铺于96孔细胞培养板中。
骨髓瘤细胞（SP2/0）准备：在融合前4-5天复苏骨髓瘤细胞，进行培养换液，使其处于对数增长期。
脾细胞准备：取免疫后的小鼠，脱颈处死并消毒，无菌条件下取出脾脏，研磨成单个脾细胞悬液，低速离心后弃上清，用培养基重悬备用。
二、细胞融合
1.细胞混合：
将脾细胞和骨髓瘤细胞按一定比例（如脾细胞:SP2/0=2:1~3:1）混合于50mL无菌离心管中，低速离心（1000rpm，10分钟）后弃上清。
2.融合剂处理：
轻轻敲散细胞团块，使细胞在管底均匀混合铺开。
加入预热至37℃的50%PEG溶液，在1分钟内逐滴均匀加入，边加边轻轻摇动离心管。
加完后，37℃静置反应1分钟。
3.终止融合：
在1分钟内加入10~15mL预热至37℃的DMEM培养基，由慢至快逐步滴加，以终止PEG的促融合作用。
低速离心（1000rpm，10分钟）后弃上清。
三、融合细胞培养
1.细胞重悬：
使用预热至37℃的FBS-DMEM（HAT）培养基重悬细胞，制成细胞悬液。注意动作轻柔，避免用力吹打破坏融合细胞。
2.铺板培养：
将提前一天已加入饲养细胞的96孔细胞培养板取出，吸出上清液。
将制备好的细胞悬液加入96孔板中，每孔200μL。
将培养板放入5%CO₂恒温培养箱中培养观察。
四、融合细胞筛选与培养
1.初步筛选：
融合细胞在FBS-DMEM（HAT）培养基中培养3~7天后，根据细胞融合情况，更换为FBS-DMEM（HT）培养基，继续培养。
观察细胞形态，根据细胞生长情况，在4~7天后使用ELISA等方法进行融合阳性细胞的筛选。
2.扩大培养：
将筛选出的阳性细胞进行扩大培养，用于后续的实验或应用。
五、注意事项
1.无菌操作：整个实验过程应在无菌条件下进行，确保实验材料的无污染。
2.细胞状态：确保参与融合的细胞处于良好的生长状态，以提高融合效率。
3.试剂预热：PEG溶液和培养基在使用前应预热至37℃，以减少对细胞的刺激。
4.轻柔操作：在细胞融合和重悬过程中，动作应轻柔，避免用力吹打或震荡，以免破坏融合细胞。
