一、原理
内毒素，也称为脂多糖（LPS），是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，具有强烈的免疫原性和毒性。内毒素检测（光度法）利用鲎试剂（LAL，Limulus Amebocyte Lysate）与内毒素之间的特异性反应。当内毒素存在时，它会激活LAL中的酶原，使其转变为具有活性的酶。这种酶能够催化特定的底物（如Ac-lle-Glu-Ala-Arg-pNA）发生反应，释放出有色产物（如pNA）。通过光度计测量反应液中产物的吸光度变化，可以间接反映内毒素的浓度。
具体来说，光度法内毒素检测分为浊度法和显色基质法两种：
浊度法：通过检测反应过程中溶液浊度的变化来测定内毒素含量。随着内毒素浓度的增加，反应混合物的浊度（即吸光度或透光率的变化）也会相应增加。
显色基质法：利用凝固酶使特定底物释放出呈色团，通过测量呈色团的吸光度来测定内毒素含量。
二、操作步骤（以显色基质法为例）
1.准备试剂和材料
鲎试剂（LAL）
内毒素工作标准品（用于制备标准曲线）
内毒素检查用水（无内毒素污染）
缓冲液（用于溶解鲎试剂和样品）
微量移液器及吸头
96孔板或试管
光度计
2.试剂准备
按照说明书要求，将鲎试剂溶解于缓冲液中，制备成工作浓度的鲎试剂溶液。
使用内毒素检查用水制备一系列浓度的内毒素标准溶液，用于绘制标准曲线。
3.样品处理
根据需要，将待测样品进行适当的稀释，确保内毒素浓度在鲎试剂的检测范围内。
4.加样与反应
在96孔板或试管中，分别加入鲎试剂溶液和内毒素标准溶液或待测样品溶液。
轻轻混匀，避免产生气泡。
在适宜的温度下（通常为37℃）孵育一段时间（根据试剂说明书确定）。
5.吸光度测量
使用光度计，在特定的波长下（如405nm）测量反应液的吸光度。
结果计算
以内毒素标准溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
根据待测样品的吸光度值，在标准曲线上查找对应的内毒素浓度。
三、注意事项
1.试剂保存：鲎试剂应保存在低温条件下，避免反复冻融。
2.操作环境：实验应在无内毒素污染的环境中进行，使用无内毒素污染的器具。
3.样品处理：样品处理过程中应避免内毒素的污染和降解。
4.反应条件：严格按照试剂说明书要求的温度和时间进行孵育。
5.结果分析：注意排除可能的干扰因素，如样品中的其他成分可能对吸光度测量产生影响。
