一、原理
重组C因子法是一种基于基因重组技术的新型内毒素检测方法。该方法利用重组产生的C因子（rFC），它是马蹄蟹（鲎）凝血级联反应中的第一个组成部分。当内毒素存在时，它会与重组C因子结合并激活其活性。激活后的重组C因子能够切割特定的合成底物，释放荧光基团。通过测量释放的荧光强度，可以间接反映内毒素的浓度。
具体来说，反应在96孔板中进行，使用特定的激发/发射波长（如380/440nm）来检测荧光信号。净荧光的对数与内毒素浓度的对数成正比，并且在一定的浓度范围内（如0.005-5.0 EU/ml）呈线性关系。
二、操作步骤
1.试剂准备
将重组C因子（rFC）酶溶液和荧光底物从冰箱中取出，平衡至室温。
根据需要，准备一系列浓度的内毒素标准品溶液，用于绘制标准曲线。
2.加样
在96孔板中，分别加入空白对照溶液、内毒素标准品溶液以及待测样品溶液。加样体积通常为100μL。
3.预孵育
将96孔板放入荧光酶标仪中，在37°C ± 1°C的温度下预热10分钟。
4.加入试剂
向每个孔中加入100μL的重组C因子/底物试剂混合物（按照说明书要求的比例混合）。
5.读板与孵育
立即在荧光酶标仪中读取初始荧光值（激发/发射波长380/440nm）。
将96孔板继续在荧光酶标仪中孵育60分钟。
6.再次读板
孵育结束后，再次在荧光酶标仪中读取荧光值。
数据处理
计算每个孔的修正荧光值（60分钟读取的荧光值减去初始荧光值）。
使用修正后的空白对照荧光值对标准品和样品的修正荧光值进行标准化。
以标准化的标准品荧光值的对数值为横坐标，对应的内毒素浓度值的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。
根据待测样品的标准化荧光值，在标准曲线上查找对应的内毒素浓度。
三、注意事项
1.试剂保存：重组C因子酶溶液和荧光底物应存放在适当的温度下，避免反复冻融。
2.操作环境：实验应在清洁、无内毒素污染的环境中进行，使用无内毒素污染的器具。
3.样品处理：待测样品应进行适当的预处理，以去除可能干扰检测的物质。
4.仪器校准：使用前应对荧光酶标仪进行校准，确保测量结果的准确性。
5.结果分析：注意排除可能的干扰因素，如样品中的其他成分可能对荧光信号产生影响。
