一、技术原理
胶原蛋白在酸性条件（如醋酸溶液，pH 3-4）下溶解为可溶性单体，而在中性或弱碱性条件（pH 7-8）下，其分子内三股螺旋结构通过氢键和疏水作用自组装，形成纤维状网络，最终交联成凝胶。
透析法通过半透膜逐步去除酸性小分子（如醋酸根离子），使溶液pH缓慢升高至中性，触发胶原蛋白的自组装过程，最终形成中性凝胶。
二、实验材料与设备
1.胶原蛋白原料：酸溶性胶原蛋白（如I型胶原，来源于牛真皮或重组表达）。
2.透析装置：
透析袋（截留分子量 > 30 kDa，允许小分子通过但截留胶原蛋白）。
透析夹/密封夹。
缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，含137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄）。
辅助设备：磁力搅拌器、pH计、低温环境（4℃）。
三、实验步骤
1.胶原蛋白溶液制备
将胶原蛋白溶解于0.02 M醋酸溶液（pH 3.5），浓度通常为1-5 mg/mL。
4℃搅拌过夜，确保完全溶解（避免高温破坏三股螺旋）。
2.透析袋预处理
剪取适当长度透析袋（如10 cm），用蒸馏水清洗后煮沸10分钟，冷却备用。
3.装样与透析
将胶原蛋白溶液转移至透析袋，用透析夹密封两端，避免泄漏。
将透析袋浸入预冷的PBS缓冲液（体积为样品体积的100倍以上），4℃搅拌透析。
更换缓冲液：每2-4小时更换一次新鲜PBS，共3-5次，直至透析袋内pH接近中性（用pH试纸或pH计监测）。
4.凝胶形成与收集
透析结束后，胶原蛋白溶液逐渐浑浊并凝固成凝胶（时间取决于浓度和温度）。
将凝胶转移至模具或培养皿中，4℃静置过夜以稳定结构。
四、关键参数优化
1.pH控制
初始pH需足够低（<4）以溶解胶原，透析后pH应缓慢升至7.2-7.6。
加速凝胶化：可在透析液中添加少量NaOH（需谨慎操作，避免局部过碱）。
2.温度与浓度
低温（4℃）：减缓凝胶速度，利于形成均匀网络；高温（37℃）加速自组装但可能增加沉淀风险。
3.胶原浓度：
1-2 mg/mL：形成软凝胶，适合细胞培养。
3-5 mg/mL：形成硬凝胶，适合组织工程支架。
4.离子强度
PBS中高盐浓度（如含NaCl）可屏蔽胶原纤维间的静电排斥，促进凝胶化。
五、质量控制与表征
1.凝胶形态观察：扫描电镜（SEM）观察纤维排列与孔隙结构。
2.力学性能：流变仪测定储能模量（G'）和损耗模量（G''）。
3.生物相容性：体外细胞培养（如成纤维细胞）评估细胞黏附与增殖。
4.稳定性：检测凝胶在生理条件下的降解速率（如胶原酶处理）。
六、应用场景
1.组织工程：作为三维支架引导细胞生长（如皮肤、软骨修复）。
2.药物递送：负载生长因子或药物，实现可控释放。
3.细胞实验：模拟细胞外基质（ECM）环境，研究细胞行为。
七、注意事项
1.避免气泡：装样时倾斜透析袋，防止气泡破坏凝胶均一性。
2.无菌操作：若用于细胞实验，需全程无菌处理。
3.交联增强：如需提高稳定性，可添加交联剂（如EDC/NHS），但需控制反应条件避免过度交联。
