一、切向流过滤原理
1.分离机制：通过泵驱动料液沿膜表面切向流动，小分子杂质（如盐分、代谢物）透过膜（滤出液），而大分子血红蛋白被截留（浓缩液）。
2.优势：连续操作、高通量、低剪切力，适合处理高黏度料液（如细胞裂解液）。
二、 血红蛋白纯化流程
步骤1：样品预处理
1.细胞裂解：通过渗透压休克或机械破碎释放红细胞内的血红蛋白。
2.粗过滤：离心或预过滤（0.45 μm滤膜）去除大块碎片，防止堵塞TFF膜。
步骤2：膜孔径选择
1.截留分子量（MWCO）：根据血红蛋白分子量（64.5 kDa），选择50-100 kDa膜。
2.50 kDa膜：截留Hb，允许小分子杂质通过。
3.100 kDa膜：适用于含较大杂质（如细胞碎片）的料液。
4.膜材质：聚醚砜（PES）、再生纤维素（RC）等，需验证与Hb的兼容性。
步骤3：操作参数优化
1.流速（Flux）：控制跨膜压差（TMP）≤0.3 bar，避免膜损伤。
2.浓缩倍数：通过循环过滤提高Hb浓度，同时监测膜通量衰减。
3.换液（Diafiltration）：用缓冲液置换杂质，提升纯度。
步骤4：后处理
1.收集浓缩液：通过无菌过滤（0.22 μm）分装保存。
2.膜清洗：NaOH或蛋白酶清洗，延长膜寿命。
三、关键控制点
1.温度控制：4℃操作减少Hb变性风险。
2.pH与缓冲液：维持中性pH（如磷酸盐缓冲液），避免Hb沉淀。
3.膜污染监控：通过通量下降率评估，必要时更换膜包。
四、纯化效果评估
1.纯度分析：SDS-PAGE、HPLC-SEC或质谱法验证Hb纯度。
2.回收率：计算Hb总量在流程中的保留比例（通常≥90%）。
3.内毒素检测：鲎试剂法（LAL）确保符合药典标准。
五、 应用案例
1.规模化生产：TFF可线性放大至数千升规模，适合工业级Hb纯化。
2.联用工艺：与层析法（如离子交换、亲和层析）结合，进一步提升纯度。
六、总结
切向流过滤通过高效分离与浓缩特性，成为血红蛋白纯化的核心步骤之一。通过优化膜参数、操作条件及后处理策略，可实现高纯度、高回收率的Hb制备，适用于基础研究及生物制药领域。
