1. 标记物的选择
电子密度致密的标记物：如铁蛋白、辣根过氧化物酶（HRP）等。铁蛋白电子密度高，反差大，但分子量大，穿透能力差，适合细胞表面抗原的定位。HRP分子量小，穿透力强，适合细胞内抗原的定位。
放射性同位素：如¹³⁵I、³⁵S、³²P、¹⁴C、³H等，但这类标记物在免疫电镜中应用较少。
独特形状的标记物：如血兰蛋白、噬菌体等，这些标记物具有特定的形状，有助于在电镜下识别。
2. 固定剂的选择与固定条件
固定剂的要求：不损害细胞内抗原的活性；固定速度快、效果好；分子量小，易于渗透；固定后不引起交联，影响标记抗体进入抗原位。
常用固定剂：4%聚甲醛、1.5%~2%戊二醛、1%多聚甲醛+1%戊二醛、4%多聚甲醛+0.5%苦味酸+0.25%戊二醛、96%乙醇+1%醋酸等。
固定条件：包括固定剂的种类、浓度、pH值、温度、固定时间等。这些因素都会影响固定效果，需要根据实验需求进行优化。
3. 标记染色法
直接染色法：用标记抗体与相应抗原直接结合，操作简便，特异性高，但敏感性较低。
间接染色法：先用未标记的特异性第一抗体与样品中的相应抗原结合，然后再以标记的第二抗体与第一抗体结合。这种方法敏感性较高，但特异性相对较差。
4. 对照实验
为证实免疫标记结果的特异性，必须同时进行对照实验。对照实验包括用未经免疫的同种动物正常血清代替第一抗体、不加一抗、用不含有靶抗原的标本进行免疫标记等。
5. 结果观察与解析
在电镜下观察免疫标记的结果，通过标记物（如胶体金、铁蛋白或酶底物）显示免疫反应部位以定位抗原的存在位置。
注意区分特异性标记和背景的非特异性标记，进行正确的结果分析。
6. 样本制备中的常见问题及解决方案
抗原量低：使用更长的孵育时间和更浓缩的初级抗体。
抗体质量问题：确保抗体的特异性、滴度、储存条件等。
溶液的pH值：调节pH值以优化抗原抗体结合条件。
阴性染色问题：降低负染料的浓度或使用较大的金颗粒来改善。
薄膜加热问题：通过缓慢增加电子束的强度来稳定薄膜，或使用真空蒸发器在格栅上再涂一层直接碳。
7. 患者的配合与注意事项
对于需要采血的患者，采血时需注意保持手臂姿势稳定，避免随意移动。
患者需尽量放松心情，避免紧张情绪导致血管收缩增加采血困难。
若出现晕针症状，应立即平卧休息，待症状缓解后再进行检测。
采血结束后需用无菌棉棒按压针孔处直至不出血，并避免针孔处沾水或按揉。
