蛋白电泳是生物医学研究中的常用技术，用于分析蛋白质的分子量、纯度和表达水平。然而，许多科研人员在操作时会遇到电泳失败的问题，如条带模糊、拖尾或无条带出现，这不仅浪费时间和试剂，还可能延误实验进度。本文将从蛋白电泳的基本原理和步骤出发，探讨影响电泳成功的常见因素，并提供实用的操作技巧和问题解决方法，帮助科研人员提高电泳的成功率。
一、蛋白电泳的基本原理与步骤
蛋白电泳是一种基于蛋白质分子量差异进行分离和分析的技术，广泛应用于生物医学研究中。其核心原理是利用电场驱动带电的蛋白质分子在凝胶介质中迁移，从而实现分离。以下是蛋白电泳的基本原理和操作步骤的简要介绍。
（一）基本原理
在SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）中，蛋白质首先通过SDS（十二烷基硫酸钠）处理，使蛋白质解离成单条肽链，并均匀带上负电荷。由于电泳过程中所有蛋白质的电荷密度相同，其迁移速度主要取决于分子量大小。分子量越大的蛋白质在凝胶中的迁移速度越慢，从而实现不同分子量蛋白质的分离。
（二）操作步骤
1. 样品制备
样品制备是电泳成功的关键第一步。首先，将蛋白质样品与裂解液混合，加入适量的还原剂（如β-巯基乙醇或DTT）以确保蛋白质充分变性。随后，将样品置于沸水浴中加热5-10分钟，使蛋白质完全展开。最后，通过BCA试剂盒或Bradford试剂盒测定样品浓度，并稀释至适合的范围（考马斯亮蓝染色时，浓度约1-5 µg/µL；银染时，浓度约0.1-1 µg/µL）。
2. 凝胶配制
根据目标蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度（8%-15%）。将丙烯酰胺、过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）混合均匀后倒入模具中，避免气泡的产生。凝胶凝固后，加入电泳缓冲液，确保凝胶完全浸没。
3. 加样与电泳
将处理好的样品加入凝胶孔中，注意加样量（一般10-20 µL）。随后，将凝胶放入电泳槽中，设置合适的电压（小型凝胶80-120V），并根据凝胶大小和蛋白分子量调整电泳时间（通常45分钟到1小时）。当指示染料接近凝胶底部时，停止电泳。
4. 染色与脱色
电泳完成后，将凝胶浸泡在染色液中进行染色（考马斯亮蓝染色30分钟到1小时）。染色后，用脱色液（40%甲醇和10%乙酸）去除背景染料，使蛋白条带更加清晰（脱色时间2-3小时）。若使用银染，需严格按照试剂说明书操作，注意避光保存。
三、影响蛋白电泳成功的常见因素
蛋白电泳的成功依赖于样品处理、凝胶配制和电泳条件的优化。以下是这些因素的精简总结，帮助科研人员快速排查和解决问题。
（一）样品处理问题
1. 蛋白质变性不完全
如果加热时间不足或还原剂浓度不够，蛋白质可能无法完全变性，导致电泳条带模糊或拖尾。建议将样品在沸水浴中加热5-10分钟，并确保样品中还原剂（如β-巯基乙醇或DTT）浓度在1-5 mM之间，以保证蛋白质充分展开。
2. 样品浓度过高或过低
样品浓度过高会导致条带过宽、分辨率下降；浓度过低则可能使条带过淡甚至无法检测。建议使用BCA试剂盒测定样品浓度，并稀释至合适范围（考马斯亮蓝染色时，浓度约1-5 µg/µL；银染时，浓度约0.1-1 µg/µL）。此外，加样量也需控制，一般每孔加样10-20 µL。
3. 样品中杂质的干扰
样品中可能含有核酸、脂质等杂质，干扰电泳效果。例如，核酸会形成额外条带，脂质可能导致凝胶表面不均匀。建议在提取蛋白质时加入核酸酶去除核酸，并通过离心或过滤去除不溶性杂质。
（二）凝胶配制问题
1. 凝胶浓度选择不当
凝胶浓度影响蛋白质的分离效果。过高的浓度会使大分子蛋白质难以迁移，而过低的浓度则无法有效分离小分子蛋白质。对于分子量在10-200 kDa的蛋白质，建议选择8%-15%的凝胶浓度。例如，50 kDa的蛋白质适合10%-12%的凝胶，100 kDa的蛋白质适合8%-10%的凝胶。
2. 凝胶配制中的气泡与不均匀现象
气泡会导致凝胶中出现空隙，影响电泳的均匀性。配制凝胶时，需轻轻搅拌试剂，避免剧烈震荡，并缓慢倒入模具中。若发现气泡，可在凝胶凝固前用细针轻轻挑破。
3. 凝胶保存与使用时间
凝胶应尽快使用，以避免失水变干。室温下，凝胶可保存1-2天；若需长期保存，可置于4℃冰箱中。使用前需检查凝胶状态，确保无干燥、发霉或裂痕。
（三）电泳条件问题
1. 电压与电流设置不合理
电压和电流是电泳的关键参数。过高的电压可能导致条带模糊，过低则延长电泳时间。建议小型凝胶使用80-120V的电压，避免过热或条带跑出凝胶。
2. 电泳时间过长或过短
电泳时间需根据凝胶浓度和蛋白分子量调整。时间过短会导致分离不完全，过长则可能使条带跑出凝胶。建议小型凝胶电泳时间为45分钟到1小时，当指示染料接近凝胶底部时停止电泳。
3. 缓冲液的选择与更换
缓冲液的质量和更换频率对电泳效果至关重要。建议使用新鲜配制的缓冲液，并在电泳3-4次后更换。若缓冲液变浑浊或电泳效果不佳，需及时更换。
（四）染色与脱色问题
1.染色时间与浓度控制：考马斯亮蓝染色操作简单但灵敏度低，银染灵敏度高但操作复杂。染色时间需根据染色试剂和凝胶状态调整。
2.脱色不完全或过度脱色：脱色时间过长可能导致背景过高，过短则条带不清晰。建议根据染色效果调整脱色时间。
3.染色试剂的质量与保存：确保染色试剂在有效期内，并妥善保存，避免失效。
四、常见问题排查与解决方法
蛋白电泳过程中可能会出现各种问题，如条带模糊、条带缺失或位置异常。以下是一些常见问题的原因分析和解决方法。
（一）条带异常
1. 条带模糊、拖尾或弥散
原因可能是蛋白质变性不完全、样品浓度过高或凝胶浓度过低。解决方法：确保蛋白质充分变性，调整样品浓度，选择合适的凝胶浓度。
2. 条带缺失或不完整
可能是样品中蛋白质含量过低或加样量不足。建议优化样品提取过程，增加加样量，并确保样品均匀加入凝胶孔中。
3. 条带位置异常
可能是电压设置过高或电泳时间过长，导致蛋白质迁移过快。调整电压和电泳时间，确保电泳条件适合目标蛋白。
（二）电泳失败的原因分析
1. 样品问题排查
检查样品是否充分变性，浓度过高或过低，或存在杂质干扰。优化样品制备过程，确保样品质量。
2. 凝胶问题排查
检查凝胶浓度是否合适，是否产生气泡或不均匀现象。确保凝胶配制和保存条件正确。
3. 电泳条件排查
检查电压、电流和电泳时间是否合适，缓冲液是否新鲜。优化电泳条件，确保电泳过程稳定。
