一、引言

细胞铺板是细胞实验的起点，也是决定实验成败的关键步骤之一。合适的细胞浓度不仅能够确保细胞在培养过程中正常生长和增殖，还能直接影响实验结果的准确性和可重复性。细胞浓度过高会导致细胞聚集，引发细胞间的信号干扰，甚至导致营养竞争，影响细胞的正常生长和代谢；而浓度过低则可能使细胞在培养环境中难以形成良好的细胞间连接，导致细胞功能异常甚至死亡。无论是细胞增殖、分化还是联合培养等实验，准确的细胞铺板浓度都是成功的关键。

 

二、影响细胞铺板浓度的因素

（一）细胞类型差异

不同的细胞系对生长环境和密度有不同的要求。贴壁细胞（如成纤维细胞、上皮细胞）通常需要一定的细胞密度来维持贴壁生长，而悬浮细胞（如淋巴细胞、癌细胞）则可以在较低的密度下生长。一般来说，贴壁细胞的铺板浓度建议在每平方厘米 1×10⁴ - 1×10⁵个细胞之间，而悬浮细胞则可以在 1×10⁵ - 5×10⁵个细胞/mL 的范围内进行培养。以常见的 Hela 细胞为例，其贴壁生长特性要求在铺板时保持较高的初始密度，以确保细胞能够快速贴壁并形成单层结构。

（二）实验目的导向

细胞实验的目标也会影响铺板浓度的选择。如果实验目的是细胞增殖，那么需要保证细胞有足够的空间和营养进行快速扩增，此时铺板浓度可以相对较低。例如，在进行细胞克隆实验时，需要在稀释后的细胞悬液中铺板，确保每个孔中只有一个细胞，从而实现单克隆培养。而如果是细胞分化实验，如诱导胚胎干细胞分化为特定细胞类型，则需要较高的细胞密度，以促进细胞间的信号交流和自分泌作用，此时铺板浓度可能需要超过 1×10⁵个细胞/cm²。

（三）培养基及容器特性

培养基的成分、营养浓度和 pH 值对细胞生长速度和维持密度至关重要。例如，含有丰富生长因子的培养基可以支持更高的细胞密度，而营养成分不足的培养基则需要降低细胞密度，以确保细胞能够获取足够的营养。此外，培养容器的表面积与体积比也会影响细胞铺板浓度。24孔板的单孔表面积相对较小，细胞密度会比 6孔板更高，因此需要根据不同的容器规格调整细胞浓度。

 

三、快速调整细胞铺板浓度的实用方法

（一）浓度测定：准确是前提

细胞浓度测定是调整铺板浓度的第一步，也是最关键的一步。常用的浓度测定方法包括血细胞计数板法和流式细胞仪法。血细胞计数板法是一种经典的细胞计数方法，适用于大部分实验室。具体操作步骤如下：

1.准备细胞悬液：轻轻吹打细胞，使其均匀分布。取适量细胞悬液，加入等体积的台盼蓝染液（用于区分活细胞和死细胞）。

2.上样：将稀释后的细胞悬液滴入血细胞计数板，轻轻盖上盖玻片，避免气泡产生。

3.显微镜观察：在显微镜下计数 5个大方格（25个小方格）内的细胞数。活细胞不被台盼蓝染色，死细胞会被染成蓝色，可以通过计算活细胞比例来评估细胞活力。

4.计算浓度：根据计数结果计算细胞浓度。公式为：细胞浓度 = （细胞数 / 5）×10⁴/mL。如果细胞活力低于 80%，建议重新分离细胞或调整培养条件。

流式细胞仪法则适用于细胞浓度较高（>1×10⁶个/mL）的样本，具有快速、准确、可同时检测细胞活力和表型的优点。但需要注意的是，流式细胞仪价格昂贵，对操作人员技术要求较高，且需要定期校准。

在进行浓度测定的过程中，要注意取样的随机性和代表性。例如，在吹打细胞时，应在多个不同位置取样，避免局部浓度偏差对结果的影响。同时，建议每次实验前进行细胞浓度测定，以确保后续操作的准确性。

（二）梯度稀释：快速找基准

梯度稀释是一种快速确定合适铺板浓度的方法，尤其适用于对细胞浓度要求较高的实验。具体操作如下：

1.准备细胞悬液：先将细胞悬液调整到一个较高的初始浓度（如 1×10⁶个/mL）。

2.梯度稀释：取 1mL初始浓度的细胞悬液，加入 9mL培养基进行 1:10 稀释，得到 1×10⁵个/mL 的悬液。再从该悬液中取 1mL，加入 9mL培养基进行 1:10 稀释，得到 1×10⁴个/mL 的悬液，以此类推，得到一系列不同浓度的细胞悬液。

3.铺板检测：将不同浓度的细胞悬液分别铺板，通常选择 24孔板进行小规模试验。每个浓度铺 3 - 5孔，便于后续统计分析。培养 24 - 48小时后，观察细胞的生长状态和铺板密度。如果细胞过密，可以选择更低浓度；如果细胞过于稀疏，则提高浓度。通过这种方法，可以快速找到合适的铺板浓度范围。

（三）实时监测与微调

随着细胞培养技术的发展，实时细胞分析仪器（如 IncuCyte 或实时细胞电子传感器系统）为细胞浓度的动态调整提供了可能。这些仪器可以实时监测细胞的生长、增殖和形态变化，帮助研究人员在细胞生长初期及时调整浓度。

1.仪器应用：以 IncuCyte 为例，它可以通过荧光标记或相位成像技术实时观察细胞密度和覆盖率。在细胞铺板后，将培养容器放入仪器中，设定合适的参数（如成像时间间隔、荧光波长等），仪器会自动拍摄图像并分析细胞覆盖率。

2.数据解读与调整：根据仪器提供的数据，如果发现细胞生长过快且密度接近饱和，可以通过胰酶轻度消化后重新调整浓度；如果细胞生长缓慢且密度较低，则可以补充适量细胞悬液，快速提高细胞密度。需要注意的是，这些调整应在细胞生长初期（24 - 48小时内）进行，以避免对细胞造成过大应激。

 

四、浓度调整的注意事项

在细胞培养中，调整细胞浓度看似简单，但稍不注意就可能引入误差甚至导致实验失败。以下是一些在浓度调整过程中需要注意的关键事项，希望能帮助大家避免常见问题。

（一）细胞状态与活力评估

细胞的活力是浓度调整前必须优先考虑的因素。如果细胞本身已经受损或死亡，即使调整了浓度，后续实验也会受到严重影响。因此，在调整浓度之前，一定要进行细胞活力检测，确保细胞处于健康状态。

1. 台盼蓝染色法

这是最常用的细胞活力检测方法之一，操作简单且结果直观。具体步骤如下：

1.准备材料：台盼蓝染液（0.4%），显微镜，血细胞计数板。

2.染色步骤：从细胞悬液中取少量（约10μL），加入等体积的台盼蓝染液，轻轻混匀。

3.观察计数：将染色后的细胞悬液滴入血细胞计数板，放在显微镜下观察。活细胞会排斥台盼蓝，保持透明；而死细胞会被染成蓝色。

4.计算活力：统计活细胞和死细胞的数量，计算细胞活力（活力 = 活细胞数 / 总细胞数 × 100%）。一般建议细胞活力高于80%时再进行后续操作。

2. MTT实验

如果需要更精确地评估细胞代谢活性，MTT实验是一个不错的选择。它通过检测细胞将MTT转化为紫色甲瓒的能力来反映细胞活力。虽然操作相对复杂，但结果更为定量：

1.准备材料：MTT试剂，培养基，酶标仪。

2.操作步骤：将细胞按一定浓度铺在96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液。培养一段时间后，加入10μL MTT溶液（5mg/mL），继续培养4小时。

3.溶解甲瓒：吸去上清，加入DMSO溶解甲瓒，用酶标仪在570nm处测定吸光值。

4.计算活力：根据吸光值计算细胞活力，活力较高的细胞群体更适合进行浓度调整。

（二）操作规范与无菌意识

细胞培养过程中，无菌操作是基本要求，任何疏忽都可能导致污染，不仅影响细胞浓度，还可能直接导致实验失败。

1. 超净台的正确使用

提前准备：在操作前30分钟打开超净台的紫外灯进行消毒，关闭紫外灯后等待10分钟，让臭氧散去。

物品摆放：将所有需要的试剂和耗材提前放入超净台内，避免频繁进出超净台，减少污染风险。

操作姿势：操作时身体与超净台保持一定距离，避免阻挡空气流动。动作要轻柔，避免剧烈晃动产生气溶胶。

2. 操作动作规范

细胞悬液处理：在吹打细胞时，动作要轻柔且均匀，避免产生过多气泡。每次吹打后，轻轻敲击培养瓶侧面，让细胞充分悬浮。

移液操作：使用移液器时，确保枪头与液体垂直接触，避免液体溅出或吸入过多空气。移液后，轻轻吹打混匀，但不要过度。

培养基更换：在更换培养基时，动作要轻柔，避免吹起细胞。吸去旧培养基时，从培养容器的边缘缓缓吸出，避免直接吸到细胞层。

（三）记录与总结经验

细胞培养过程中，详细记录是优化实验流程的关键。建议建立完整的细胞培养记录，内容包括：

1.细胞来源：记录细胞的来源、传代次数、冻存时间等基本信息。

2.操作步骤：详细记录浓度调整的具体操作，包括细胞浓度测定方法、稀释比例、铺板浓度等。

3.结果与问题：记录细胞的生长状态、活力检测结果以及遇到的问题和解决方法。

 

通过总结经验，可以逐步优化实验室的细胞浓度调整流程。例如，如果发现某个细胞系在特定浓度下容易聚集，可以在后续实验中适当调整浓度范围；如果某个操作步骤经常出现问题，可以尝试改进操作方法或设备。

此外，定期与其他实验室人员交流经验，也能帮助大家共同提高细胞培养的效率和成功率。总之，细胞浓度调整虽然只是细胞培养中的一个小环节，但细节决定成败。只有在细胞状态良好、操作规范且有经验积累的情况下，才能确保细胞培养的顺利进行。