一、核心方法原理与适用场景

1. 紫外分光光度法（UV Spectrophotometry）

原理：利用核酸在260nm处的紫外吸收特性（碱基共轭双键），结合朗伯-比尔定律（A=εcb）计算浓度。

仪器代表：NanoDrop（1-2μL样品，2-3分钟出结果）。

优点：操作简单，无需染料或标准品。

局限：

灵敏度有限（dsDNA检测下限2ng/μL）。

无法区分DNA/RNA，受游离核苷酸、蛋白质干扰。

适用场景：常规核酸浓度检测（如PCR产物分析、质粒提取评估）。

2. 荧光光度法（Fluorometry）

原理：特异性荧光染料（如SYBR Green、PicoGreen）与核酸结合后发射荧光，强度与核酸量成正比。

仪器代表：Qubit（5分钟出结果）。

优点：灵敏度高（pg级），可区分DNA/RNA。

局限：需标准曲线，染料成本高。

适用场景：微量核酸定量（如基因表达分析、病毒载量监测）。

3. 实时荧光定量PCR（qPCR）

原理：通过Ct值与起始模板浓度的对数反比关系定量，需标准曲线。

仪器代表：ABI 7500、Roche LightCycler。

优点：特异性高，灵敏度达fg级。

局限：操作复杂，依赖引物/探针设计。

适用场景：低浓度核酸、基因表达分析、病原体检测。

4. 数字PCR（dPCR）

原理：将反应体系分割为微滴，统计荧光信号阳性微滴数，通过泊松分布计算浓度。

仪器代表：Bio-Rad QX200。

优点：绝对定量，抗干扰性强。

局限：成本高，需预实验确定浓度范围。

适用场景：稀有突变检测、拷贝数变异分析。

5. 定磷法/定糖法（传统比色法）

原理：

定磷法：核酸磷含量与钼蓝化合物吸光度成正比。

定糖法：戊糖脱水生成醛类化合物，与成色剂反应显色。

优点：成本低，操作简便。

局限：准确性低，易受杂质干扰。

适用场景：粗略估计核酸含量（如教学实验）。

 

二、方法选择决策树

1.优先紫外分光光度法：

样品浓度＞0.25ng/μL，需快速检测且不要求区分DNA/RNA。

2.选择荧光光度法：

微量核酸（pg级），需区分DNA/RNA或避免杂质干扰。

3.采用qPCR/dPCR：

低浓度核酸（fg级），需高灵敏度或特异性检测（如病原体、稀有突变）。

4.慎用传统比色法：

仅用于科研初步筛选或教学演示。

 

三、最新技术进展与趋势

1.灵敏度革命：

核酸检测试剂最低检出限达100拷贝/mL，总体检出率＞95%。

2.速度突破：

传统方法需4小时，现缩短至1小时（最快30分钟）。

3.自动化升级：

一体化检测设备实现“样品进-结果出”，减少人为误差。

4.多场景覆盖：

便携式产品（现场检测）、多病毒联检试剂（呼吸道病毒6联检）。

5.技术融合：

纳米孔测序：实时分析核酸浓度与序列（如Oxford Nanopore）。

微流控芯片：集成核酸提取、扩增与检测，提升通量。

 

四、关键质量控制点

1.纯度评估：

A260/A280比值（DNA≈1.8，RNA≈2.0）初步判断蛋白质污染。

A260/A230比值＜2.0提示盐类或有机物残留。

2.标准曲线验证：

qPCR/荧光法中，R²＞0.99确保定量准确性。

3.重复实验：

至少3次独立实验，计算CV值（＜5%为优）。

 

五、未来方向

1.单分子检测：结合纳米技术实现单分子核酸计数。

2.AI辅助分析：深度学习模型预测核酸浓度，降低人为误差。

3.临床转化：开发即时检测（POCT）设备，适配基层医疗。

 

通过合理选择方法、严格质量控制及技术更新，可实现核酸浓度的精准定量，为分子生物学研究提供可靠数据支持。