一、实验准备
1.类器官准备
提前一周复苏培养类器官至状态良好。
取合适数量的类器官，使用预冷PBS清洗数次，去除大部分基质胶。
使用培养基重悬类器官。
2.PBMC（外周血单个核细胞）分离
在无菌环境下，使用添加EDTA-K2的真空采血管采集外周血，并运输保存。
将新鲜静脉血与PBS缓冲液按一定比例稀释，轻轻混匀待用。
使用细胞分离液（如Ficoll法）进行密度梯度离心，分离出PBMC。
对PBMC进行计数，并计算细胞活力。
3.试剂准备
准备T细胞无血清完全培养基，包括免疫细胞无血清培养基、IL-2（刺激T细胞生长与增殖）、CD3/CD28磁珠（激活T细胞）等。
准备类器官无血清培养基。
准备96孔超低吸附培养板等实验器具。
二、共培养步骤
1.PBMC处理
使用T细胞无血清完全培养基重悬PBMC，调整至合适浓度。
在96孔板中，每孔加入一定量的PBMC悬液（如5×10^5个PBMC/每孔，100μL细胞悬液/每孔）。
2.类器官处理
使用类器官无血清培养基重悬类器官，调整至合适浓度。
向含有PBMC的96孔板中加入等量的类器官悬液（如250-333个类器官/每孔，100μL类器官悬液/每孔），使总体积达到200μL。
3.培养观察
在37℃，5% CO2条件下进行培养，每日连续观察。
在培养过程中，根据需要吸出部分培养上清，加入新培养基，并可以加入处理抗体或药物等。
记录细胞状态，并在实验组间差异显著时拍照记录大视野细胞明场形态。
三、检测与分析
1.T细胞靶向识别杀伤检测
使用CD31抗体偶联FITC等标记T细胞，追踪和分析T细胞的行为，如迁移、分布和与类器官的相互作用。
使用高内涵录像及拍照技术，实时检测T细胞对类器官的识别及趋向运动。
2.免疫浸润检测
将共培养后的类器官和悬浮的T细胞分离。
对类器官进行石蜡切片免疫组化分析，检测T细胞在类器官中的浸润情况。
3.类器官毒性LDH检测
使用乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒，检测共培养上清中的LDH活性，评估类器官的毒性。
4.上清细胞因子检测
收集共培养上清液，使用细胞因子检测试剂盒检测上清中的细胞因子水平，分析免疫细胞与类器官之间的相互作用。
5.类器官活死染色
使用活死细胞染色试剂对类器官进行染色，观察类器官的存活情况。
