人类胚胎干细胞 H9 的培养步骤及方法涉及多个关键环节，包括复苏、传代、冻存等。以下是详细的步骤及方法：
一、复苏
1.准备材料：
T25 培养瓶或 6cm 培养皿
H9 完全培养基
15mL 离心管
移液管
预热好的水浴锅（37℃）
70% 乙醇
2.操作步骤：
将冻存管从液氮中取出，迅速放入 37℃水浴中解冻，轻柔持续地摇动冻存管，直到只剩下一个小冷冻团。
从水浴槽取出冻存管，用 70% 乙醇擦拭进行消毒。
使用移液管将冻存管中含有 H9 细胞的冻存液轻轻转移至一个含有 5~6mL 已经预热的完全培养基的 15mL 离心管中，过程必须轻柔防止吹散细胞团。
室温下以 300g 离心 5 分钟。
吸出培养基，确保细胞团完整。
缓慢加入 1mL 完全培养基，用手指轻弹离心管底部，使细胞团脱离底部并分散。
将此 1mL 细胞悬液转移至已包被的培养皿/板/瓶，根据最终培养细胞的液体体积，加入 ROCK inhibitor Y27632，终浓度为 10μM。
将培养皿/板/瓶置于 37℃、5% CO₂ 的培养箱中，每天更换培养基（换液时不需要再添加 Y27632，但培养基需提前预热）。
二、传代
1.准备材料：
预热好的无钙镁 PBS 溶液
消化液（如 0.25% Trypsin-0.53mM EDTA）
完全培养基
15mL 离心管
移液管
2.操作步骤：
当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，即可进行传代。
吸走上清，并加入 37℃预热好的 PBS 溶液清洗 1 次。
加入适量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃预热好的消化液。
37℃放置 1~2 分钟，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。
加入适量的完全培养基终止消化。
移入离心管，300g 离心 5 分钟。
离心后重悬（重悬步骤参照复苏 4~5 步）。
传代比例为 1:6~1:8，根据最终培养细胞的液体体积，加入 ROCK inhibitor Y27632，终浓度为 10μM。
将培养皿/板/瓶置于 37℃、5% CO₂ 的培养箱中，每天更换培养基（换液时不需要再添加 Y27632，但培养基需提前预热）。
三、冻存
1.准备材料：
预热好的无钙镁 PBS 溶液
消化液（如 0.25% Trypsin-0.53mM EDTA）
完全培养基
冻存液（如 90% H9 细胞完全培养基与 10% 的 DMSO）
冻存管
15mL 离心管
移液管
程序降温盒
-80℃ 冰箱
液氮罐
2.操作步骤：
当细胞生长至覆盖培养瓶的 80% 面积时，弃去培养瓶中的培养液，用 PBS 清洗细胞一次。
加入适量消化液至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至 15mL 离心管中，1000rpm 离心 5 分钟。
弃上清，沉淀细胞加入适量的冻存液，混匀后加入冻存管中。
将冻存管放入程序降温盒内，-80℃ 过夜，然后转入液氮罐中保存。
四、注意事项
1.无菌操作：所有操作必须在无菌条件下进行，以防止细胞污染。
2.细胞状态监控：密切观察细胞的生长状态和形态学特征，发现异常情况及时处理。
3.避免过度吹打：在复苏和传代过程中，避免过度吹打细胞，以免损伤细胞团块。
4.培养基预热：在复苏和传代时，培养基需提前预热至 37℃，以确保细胞的正常生长。
5.冻存管标识：在冻存管上做好标识，包括细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
