检测细胞活力与细胞毒性的原理和方法

细胞活力和细胞毒性检测是细胞生物学和药物研发中的重要环节，用于评估细胞的健康状态以及化合物或处理对细胞的影响。以下是检测细胞活力与细胞毒性的主要原理和方法：

一、细胞活力检测

原理：
细胞活力检测主要基于活细胞与死细胞在代谢活性、膜完整性或酶活性上的差异。活细胞能够维持代谢活动，如酶反应、ATP生成等，而死细胞或受损细胞则无法完成这些过程。

常用方法：

1.台盼蓝染色法

原理：台盼蓝是一种细胞排斥染料，无法穿透活细胞的完整细胞膜，但可以进入死细胞并使其染成蓝色。

方法：将细胞悬液与台盼蓝溶液混合，通过显微镜或细胞计数仪计数活细胞（未染色）和死细胞（染色）的比例。

优点：简单、快速、成本低。

缺点：无法区分凋亡和坏死细胞。

2.MTT法（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）

原理：活细胞中的线粒体脱氢酶能将MTT还原为不溶于水的蓝紫色甲臜结晶，而死细胞无法完成此反应。

方法：加入MTT溶液孵育后，加入溶剂溶解甲臜，通过分光光度计测定吸光度（通常570nm）。

优点：灵敏度高，适用于大规模筛选。

缺点：需要孵育时间，可能受细胞代谢状态影响。

3.CCK-8法（Cell Counting Kit-8）

原理：CCK-8试剂中的WST-8在活细胞线粒体脱氢酶的作用下被还原为橙黄色甲臜，吸光度与活细胞数量成正比。

方法：直接加入CCK-8试剂孵育后测定吸光度（450nm）。

优点：操作简便，灵敏度高，无需溶解步骤。

缺点：成本较高。

4.Calcein-AM/PI双染法

原理：Calcein-AM可穿透活细胞膜并被酯酶水解为绿色荧光物质，PI只能进入死细胞并与其DNA结合发出红色荧光。

方法：通过荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号。

优点：可区分活细胞和死细胞，适用于高通量分析。

缺点：需要荧光检测设备。

 

二、细胞毒性检测

原理：
细胞毒性检测主要评估化合物或处理对细胞的杀伤作用，通常通过检测细胞活力下降、膜完整性破坏、DNA损伤或细胞凋亡等指标来实现。

常用方法：

1.LDH释放法（乳酸脱氢酶）

原理：细胞受损时，胞内LDH释放到培养基中，通过测定LDH活性反映细胞毒性。

方法：收集培养基，加入LDH底物，测定吸光度（通常490nm）。

优点：灵敏度高，可检测早期细胞损伤。

缺点：无法区分细胞死亡类型（凋亡或坏死）。

2.Annexin V/PI双染法

原理：Annexin V可与磷脂酰丝氨酸结合，标记早期凋亡细胞；PI标记晚期凋亡和坏死细胞。

方法：通过流式细胞仪或荧光显微镜检测荧光信号。

优点：可区分凋亡和坏死细胞。

缺点：需要荧光检测设备，操作相对复杂。

3.DNA片段化检测

原理：细胞凋亡时，DNA被内源性核酸酶切割为180-200bp的片段，可通过凝胶电泳或ELISA检测。

方法：提取细胞DNA，进行琼脂糖凝胶电泳或使用DNA片段化检测试剂盒。

优点：特异性高，可确认凋亡发生。

缺点：操作繁琐，灵敏度较低。

4.克隆形成实验

原理：细胞毒性物质会抑制单个细胞形成克隆的能力，通过克隆形成率评估细胞毒性。

方法：将细胞接种于培养皿，处理后继续培养，计数克隆数。

优点：反映长期细胞存活能力。

缺点：耗时长，操作复杂。

 

三、方法比较与选择

方法	优点	缺点	适用场景
台盼蓝染色法	简单、快速、成本低	无法区分凋亡和坏死	快速评估细胞存活率
MTT法	灵敏度高，适用于大规模筛选	需要孵育时间，可能受代谢状态影响	药物筛选、细胞增殖检测
CCK-8法	操作简便，灵敏度高	成本较高	高通量细胞活力检测
Calcein-AM/PI	可区分活细胞和死细胞	需要荧光检测设备	高通量分析、细胞毒性评估
LDH释放法	灵敏度高，可检测早期细胞损伤	无法区分细胞死亡类型	细胞毒性检测、膜完整性评估
Annexin V/PI	可区分凋亡和坏死细胞	需要荧光检测设备，操作复杂	细胞凋亡检测、毒性机制研究
DNA片段化检测	特异性高，可确认凋亡发生	操作繁琐，灵敏度较低	凋亡机制研究
克隆形成实验	反映长期细胞存活能力	耗时长，操作复杂	评估长期细胞毒性

 

四、注意事项

1.实验设计：

设置阴性对照（未处理细胞）和阳性对照（已知毒性物质处理细胞）。

确保实验条件一致，避免边缘效应。

2.数据处理：

多次重复实验，取平均值以减少误差。

使用统计学方法分析数据（如t检验、ANOVA）。

3.结果解读：

结合多种方法验证结果，避免单一方法的局限性。

考虑细胞类型、处理时间和浓度的差异。

 

五、总结

细胞活力与细胞毒性检测是评估细胞健康状态和化合物安全性的重要手段。选择合适的方法需考虑实验目的、细胞类型、检测灵敏度和实验条件。通过结合多种方法，可以更全面地了解细胞的生理状态和化合物的毒性作用。