一、准备工作

1.试剂准备：

确保试剂盒中的所有组分齐全，包括变性细胞裂解液（SD-001）、天然细胞裂解液（SN-002）、离心管柱、收集管等。

根据实验需求，准备适量的1×PBS缓冲液、涡旋震荡仪、台式离心机、BCA蛋白定量试剂盒等附加材料。

2.样品准备：

对于细胞样品，需确保细胞处于良好的生长状态，并收集足够数量的细胞。

对于组织样品，需新鲜或冷冻保存，并在提取前进行适当处理（如剪碎、研磨等）。

二、总蛋白提取操作

1. 变性总蛋白提取（SD-001，适用于SDS-PAGE、WB实验）

预冷：将离心管柱套入接收管中，成为套管放置于冰上预冷。

细胞收集与清洗：

对于悬浮细胞，低速离心收集细胞，加入预冷的PBS清洗细胞，弃去上清，保留与细胞体积相同体积的PBS，涡旋震荡重悬细胞。

对于贴壁细胞，生长至90-100%融合时，用预冷的PBS清洗细胞两次，完全吸出上清。

细胞裂解：加入相应体积的变性细胞裂解液（SD-001），涡旋震荡裂解细胞。对于贴壁细胞，需将裂解液均匀加入整个器皿表面，用移液器反复吹打几次以裂解细胞。

离心与收集：将细胞裂解物转移到预冷的离心管柱套管中，盖上盖子，以14,000-16,000Xg离心30秒取出。弃去离心管柱，收集管中即是蛋白样品。

2. 天然总蛋白提取（SN-002，适用于ELISA、IP、CO-IP等实验）

预冷：将离心管柱套入接收管中，成为套管，与天然细胞裂解液（SN-002）共同放置于冰上预冷。

细胞收集与清洗：操作与变性总蛋白提取相同。

细胞裂解：加入相应体积的天然细胞裂解液（SN-002），涡旋震荡裂解细胞。对于贴壁细胞，需将裂解液均匀加入整个器皿表面，放置于冰上孵育5分钟，用移液器反复吹打以裂解细胞。

离心与收集：将细胞裂解物转移到预冷的离心管柱套管中，盖上盖子，以14,000-16,000Xg离心30秒取出。弃去离心管柱，收集管中即是蛋白样品。

3. 动物组织总蛋白提取

预冷：将离心管柱套入接收管中，成为套管放置于冰上预冷。

组织处理：将15-20mg新鲜/冷冻组织放置于离心管柱套管上，用塑料研磨棒向下按压反复扭转研磨50-60次。

裂解与孵育：

对于变性总蛋白提取，加入200μl变性细胞裂解液（SD-001），继续研磨30-60次，盖上盖子，室温孵育1-2分钟。

对于天然总蛋白提取，加入200μl天然细胞裂解液（SN-002），继续研磨30-60次，开盖冰上孵育5分钟，盖上盖子。

离心与收集：以14,000-16,000Xg离心1-2分钟取出。弃去离心管柱，收集管中即是蛋白样品。

三、注意事项

1.裂解液选择：根据下游实验需求选择合适的裂解液（变性或天然）。

2.样品处理：确保样品在提取过程中保持低温，以避免蛋白质降解。

3.离心条件：严格按照试剂盒说明书的离心条件进行操作，以确保蛋白提取效率。

4.蛋白定量：提取的蛋白样品需进行定量检测（如BCA法），以确定蛋白浓度。

四、常见问题与解决方案

1.裂解物太粘稠：将细胞裂解物倒入离心管柱中或将吸头剪掉尖端。

2.离心后离心管中仍存留细胞裂解物：减少起始细胞/组织的数量或增加细胞裂解液。

3.低蛋白浓度：增加起始细胞/组织的数量或减少细胞裂解液量。

4.高分子量范围蛋白条带弱：增加细胞裂解液量，确保细胞/组织裂解充分。