一、产品概述

质膜蛋白和细胞组分分离试剂盒是一种高效、快速的工具，用于从细胞或组织样品中分离出质膜蛋白以及其他细胞组分（如细胞核、细胞质、细胞器等）。该试剂盒利用离心管柱技术和差速离心、密度离心原理，无需超速离心，即可实现细胞组分的有效分离。

 

二、试剂盒组份

试剂盒通常包含以下组份：

1.缓冲液A：用于细胞/组织致敏，促进细胞膜破裂。

2.缓冲液B：用于质膜蛋白的进一步分离和纯化。

3.离心管柱：用于细胞样品的离心分离。

4.收集管：用于收集离心后的细胞组分。

5.塑料研磨棒：用于组织样品的研磨。

6.组织分离粉：可选，用于某些难研磨组织样品的处理。

 

三、储存条件

缓冲液A和缓冲液B应储存于-20℃。

离心管柱和收集管应室温保存。

塑料研磨棒和组织分离粉应干燥保存。

 

四、使用前准备

1.试剂解冻：将缓冲液A和缓冲液B完全解冻后摇匀，放置于冰上。

2.预冷：将离心管柱和收集管放置于冰上预冷。

3.离心机设置：调整离心机为RCF/xg模式，按照离心力设置离心机，所有离心步骤都需在4℃室温下或低温离心机中进行。

 

五、操作流程

1. 总膜组分分离

细胞样品处理：

低速离心（500-600Xg，5分钟）收集细胞。

用预冷的PBS清洗细胞一次，去除上清。

在Buffer A中重悬细胞（起始细胞数小于5X106加入200ul Buffer A，大于5X106加入500ul Buffer A）。

冰上孵育5-10分钟，涡旋大力震荡10-30秒。

迅速将细胞悬液转入离心管柱中。

组织样品处理：

将新鲜组织（10-30mg）或冷冻组织（20-30mg）放置于离心管柱上。

加入200ul Buffer A，用塑料棒反复扭转研磨组织1分钟。

再加入300ul Buffer A，用吸头吹打几次后，开盖冰上孵育5分钟。

离心与收集：

盖上盖子，16,000Xg离心30秒。

弃去离心管柱，涡旋大力震荡10秒重悬细胞。

2. 细胞组分分离

细胞核分离：

700Xg离心1分钟，沉淀为完整的细胞核。

细胞质与总膜分离：

将上清转移至新的离心管中，4℃，16,000Xg离心10-30分钟。

弃去上清（胞浆组分），保存沉淀（总膜组分，包括细胞器和质膜）。

质膜分离：

加入200ul Buffer B，用吸头反复吹打或涡旋震荡重悬总膜组份。

4℃，7,800Xg离心5分钟，沉淀部分为细胞器。

小心将上清液转移至新的离心管中，加入1.6ml预冷的PBS混匀。

16,000Xg离心15-30分钟，弃去上清液，保存沉淀（质膜）。

 

六、注意事项

1.样品量：每次实验使用同样起始样品量，以获得一致性更好的结果。

2.离心条件：严格按照说明书中的离心力和离心时间进行操作。

3.蛋白酶抑制剂：根据实验需求，可在缓冲液A中加入蛋白酶抑制剂以抑制蛋白降解。

4.研磨方式：请勿使用液氮研磨组织样品，按说明书操作。

 

七、应用

该试剂盒分离的质膜蛋白和细胞组分可应用于SDS-PAGE、免疫印迹（Western Blotting）、ELISA、免疫沉淀（IP）、膜蛋白质结构分析、2-D电泳、酶活性测定等多种实验。

 

八、常见问题与解决方案

1.低蛋白产量：增加起始细胞/组织的样品量，或增加孵育时间。

2.质膜组分中有胞浆蛋白污染：用预冷的PBS（含0.3M NaCl，pH9.5）清洗质膜沉淀。

3.离心管柱堵塞：减少起始细胞/组织的数量，或增加离心时间。