一、蛋白提取
1. 样品准备
细胞样品：
收集细胞：通过离心（如500-600×g，5分钟）收集悬浮细胞，或用胰酶消化贴壁细胞。
清洗细胞：用预冷的PBS清洗细胞1-2次，去除培养基和杂质。
组织样品：
取新鲜或冷冻组织，剪碎成小块（约1-2mm³）。
可选步骤：使用组织匀浆器或液氮研磨进一步破碎组织。
2. 细胞裂解
选择裂解液：
变性裂解液（含SDS等强去垢剂）：适用于SDS-PAGE和Western Blot。
非变性裂解液（含Triton X-100等温和去垢剂）：适用于ELISA、IP等需保留蛋白活性的实验。
可添加蛋白酶抑制剂（如PMSF）和磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解。
裂解步骤：
细胞：加入适量裂解液，涡旋震荡或超声破碎，冰上孵育10-30分钟。
组织：加入裂解液后，使用匀浆器或研磨棒充分研磨，冰上孵育30分钟。
3. 离心分离
高速离心（如14,000-16,000×g，10-30分钟）分离裂解物。
取上清液（含可溶性蛋白），弃去沉淀（含细胞碎片和不溶性物质）。
二、蛋白定量
1. 常用方法
BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）：
原理：BCA试剂与蛋白中的铜离子形成紫色络合物，吸光度与蛋白浓度成正比。
优点：灵敏度高，兼容性强，适用于大多数蛋白样品。
Bradford法：
原理：考马斯亮蓝G-250与蛋白结合后颜色变化，吸光度与蛋白浓度相关。
优点：快速简便，但受去垢剂影响较大。
Lowry法：
原理：基于Folin-酚试剂与蛋白中酪氨酸和色氨酸的反应。
优点：灵敏度高，但操作复杂，易受干扰。
2. BCA法定量步骤
制备标准曲线：
使用已知浓度的标准蛋白（如BSA），稀释成一系列浓度梯度。
加入BCA工作液，37℃孵育30分钟，测定吸光度（562nm）。
绘制标准曲线，计算蛋白浓度与吸光度的线性关系。
样品测定：
取适量蛋白样品，加入BCA工作液，同样条件下孵育并测定吸光度。
根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
3. 注意事项
样品稀释：若样品浓度过高，需适当稀释，确保吸光度在标准曲线范围内。
重复测定：每个样品至少测定2-3次，取平均值，提高准确性。
空白对照：设置不含蛋白的空白对照，扣除背景吸光度。
三、蛋白浓度调整与保存
1.浓度调整：
根据后续实验需求，使用裂解液或缓冲液调整蛋白样品至统一浓度。
2.蛋白变性：
对于SDS-PAGE，需加入上样缓冲液（含SDS和β-巯基乙醇），95℃加热5分钟使蛋白变性。
3.保存条件：
短期保存：4℃保存数天。
长期保存：-80℃保存数月，避免反复冻融。
四、常见问题与解决方案
1.蛋白浓度过低：
增加起始样品量。
优化裂解条件，确保充分裂解。
2.蛋白降解：
添加蛋白酶抑制剂。
保持低温操作，避免样品反复冻融。
3.标准曲线线性不佳：
确保标准蛋白质量可靠。
严格控制孵育时间和温度。
五、总结流程表
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步骤 |
操作要点 |
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样品准备 |
收集并清洗细胞/组织，剪碎或匀浆。 |
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细胞裂解 |
选择合适裂解液，添加抑制剂，冰上孵育。 |
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离心分离 |
高速离心取上清，弃去沉淀。 |
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蛋白定量 |
使用BCA等方法测定蛋白浓度，制备标准曲线。 |
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浓度调整 |
统一蛋白浓度，必要时变性处理。 |
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保存 |
根据需求选择保存条件，避免反复冻融。 |
关键点：蛋白提取和定量的成功依赖于样品处理、裂解条件、定量方法和操作细节的严格控制。确保每一步都按照标准流程进行，以获得高质量的蛋白样品。
