一、产品概述

活细胞/死细胞双染试剂盒（calceinAM/EthD-3）是一种用于区分活细胞和死细胞的荧光染色试剂盒。它利用两种荧光染料——Calcein-AM 和 EthD-III，分别标记活细胞和死细胞，从而实现对细胞活力的快速、准确评估。

二、产品组成

1.Calcein-AM Solution：用于标记活细胞，发绿色荧光。

2.EthD-III Solution：用于标记死细胞，发红色荧光。

3.PBS 缓冲液：用于配制染色工作液和洗涤细胞。

三、保存条件

试剂盒应保存在 -20℃ 避光条件下，有效期为一年。

四、染色原理

1.Calcein-AM：一种非荧光性染料，能够穿透活细胞的细胞膜。进入细胞后，被细胞内的酯酶剪切，生成具有强绿色荧光的 Calcein，从而标记活细胞。

2.EthD-III：一种膜非渗透性的探针，选择性染色具破损膜的死细胞。它无法穿透完整的细胞膜，但能通过死细胞膜的无序区域进入细胞核，嵌入 DNA 双螺旋结构并发出红色荧光。

五、染色步骤

1. 染色工作液的配制

根据样品数，用 PBS 缓冲液将 Calcein-AM 和 EthD-III 原液分别稀释至工作浓度。例如，可将 5μL 4mM Calcein-AM 和 12μL 2.5mM EthD-III 原液与 10mL PBS 混合，涡旋混匀，配制成染色工作液。

2. 细胞处理

贴壁细胞：先用胰酶-EDTA 消化细胞，制备成细胞悬液。或用 PBS 清洗 2~3 次后直接进行染色。

悬浮细胞：通过离心收集细胞，用 PBS 清洗后重悬。

3. 染色

Calcein-AM 染色：用适量染色工作液 A（含 Calcein-AM）重悬细胞，室温避光孵育 15-20 分钟。

洗涤：用 PBS 洗涤细胞 2-3 次，去除未结合的染料。

EthD-III 染色：用适量染色工作液 B（含 EthD-III）重悬细胞，室温避光孵育 2-5 分钟。

再次洗涤：用 PBS 洗涤细胞，去除未结合的 EthD-III。

4. 检测

荧光显微镜检测：使用 490±10nm 波长激发，观察活细胞（黄绿色荧光）和死细胞（红色荧光）。

流式细胞仪检测：通过流式细胞仪分析细胞荧光强度，区分活细胞和死细胞。

六、注意事项

Calcein-AM 的稳定性较差，染色工作液应现配现用，并在当天用完。

EthD-III 的浓度应适当，过高可能导致活细胞也被染色。建议通过梯度实验优化 EthD-III 的使用浓度。

操作时应穿实验服并戴一次性手套，避免染料接触皮肤。若接触到皮肤，应立即用自来水清洗。

贴壁细胞也可不消化直接染色，但需注意吸除培养基前用培养板离心机离心，防止丢掉漂浮的死细胞。

七、结果分析

1.荧光显微镜下：活细胞呈现黄绿色荧光，死细胞呈现红色荧光。

2.流式细胞仪分析：应获得两个相对独立的细胞群——显示绿色荧光的活细胞群和红色荧光的死细胞群。

八、应用领域

1.细胞活力评估：用于检测细胞培养过程中的细胞活力。

2.药物筛选：评估药物对细胞活力的影响。

3.细胞毒性研究：研究外源性物质对细胞的毒性作用。

总结：活细胞/死细胞双染试剂盒（calceinAM/EthD-3）是一种简单、快速、准确的细胞活力评估工具。通过荧光染色和显微镜或流式细胞仪检测，可以清晰地区分活细胞和死细胞，为细胞生物学研究提供有力支持。