一、所需材料与试剂

1.培养基：Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12。

2.补充剂：

1.5克/升碳酸氢钠

1% ITS+ Universal Culture Supplement Premix

500纳克/毫升嘌呤霉素

10%木炭/葡聚糖处理的胎牛血清

3.其他试剂：胰蛋白酶-EDTA溶液（HBSS中的0.25%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA）、细胞培养测试的DMSO。

4.实验耗材：T75细胞培养瓶、T25细胞培养瓶、nest锥形瓶、移液枪吸头等。

5.实验室仪器：-80℃冰箱、二氧化碳振荡摇床、恒温水浴锅、移液器、液氮罐、倒置显微镜等。

 

二、完全培养基的制备

1.基础培养基为DMEM/F12。

2.添加上述补充剂，确保培养基成分齐全。

3.为确保高活力，解冻小瓶并在收到后尽快开始培养。如需储存冷冻培养物，请将小瓶储存在液氮蒸气中，避免在-70℃下储存，以免导致活性丧失。

 

三、细胞解冻与接种

1.在37℃水浴中轻轻搅拌解冻小瓶，解冻过程应迅速（大约2分钟）。

2.解冻后，尽快从水浴锅中取出，并使用70%乙醇溶液进行净化，操作过程需在无菌环境中进行。

3.将小瓶内容物转移到含有6.0至8.0 mL完全培养基的离心管中，以大约125 xg的速度将细胞悬浮液离心5至7分钟。

4.丢弃上清液，并将细胞重新悬浮在新鲜的生长培养基中。

5.将此悬浮液添加到准备好的培养容器中，如T75培养瓶。

6.在37℃、5% CO₂加湿培养箱中孵育培养物。

 

四、细胞传代培养

1.传代时机：当细胞密度达到80%~90%时，进行传代培养。

2.传代步骤：

取出并丢弃旧培养基。

向烧瓶中加入2.0至3.0 mL Trypsin-EDTA溶液，在倒置显微镜下观察细胞，直至细胞层分散（通常在5至15分钟内）。

添加6.0至8.0 mL的完全生长培养基，并通过轻轻移液吸出细胞。

将细胞悬浮液转移到15 mL离心管中，并以大约125 xg的速度旋转5至10分钟。

丢弃上清液，并在新鲜生长培养基中重悬细胞。

将适当的细胞悬浮液等分试样添加到新的细胞摇瓶中。

 

五、细胞冻存与复苏

1.细胞冻存：

选择生长状态良好的细胞进行冻存。

使用无血清冻存液或含适当比例血清和DMSO的冻存液进行细胞冻存。

将细胞悬液分装到冻存管中，标记好信息后，放入程序性冻存盒中，然后放入-80℃冰箱过夜。

24小时后，将冻存管转移到液氮中进行长期保存。

2.细胞复苏：

从液氮中取出冻存管，迅速放入37℃水浴中摇晃解冻。

解冻后，将细胞悬液加入适量的培养基中混合均匀。

在适当的转速下离心，弃去上清液。

用新鲜的培养基重悬细胞后，将其接种到培养容器中过夜培养。

第二天换液并检查细胞密度和状态。

 

六、注意事项

1.避免污染：在整个细胞培养过程中，要严格遵守无菌操作规程，防止细胞污染。

2.定期观察：定期对细胞进行观察，记录细胞的生长状态、形态变化等。

3.培养基更换：根据细胞生长速度和培养基的消耗情况，定期更换新鲜的培养基。注意培养基的pH值和营养成分的变化，及时调整以维持细胞的正常生长。

4.细胞库管理：建立细胞库管理制度，对细胞的来源、传代次数、冻存与复苏记录等进行详细记录和管理。