一、冷冻切片原理
1.定义：冷冻切片是将新鲜组织或细胞在低温条件下快速冷冻固化，通过切片机切成薄片（厚度8-10 μm），用于显微观察或分子检测的技术。
2.核心优势：
快速性：从取材到诊断仅需30分钟，适用于术中病理分析。
抗原保真：低温减少蛋白变性，保留抗原活性。
适用性广：可处理脂肪、骨髓等石蜡切片难以处理的样本。
二、制作步骤
全流程图解：
1. 样本准备
新鲜组织：离体后立即送检，避免沾水（防冰晶形成）。
固定脱水（非必须）：
固定：4%多聚甲醛固定24小时（针对运输样本）。
脱水：15%→30%蔗糖溶液梯度脱水至组织沉底。
2. OCT包埋
组织修平目的面，切面朝上置于样本托。
滴加OCT包埋剂，速冻台冷冻至变白变硬。
3. 切片操作
参数设置：切片机温度-20℃至-25℃，刀片角度15-20°。
切片技巧：
粗切修整至最大切面，细切厚度8-10 μm。
用毛笔或自动展片系统防止切片卷曲。
4. 固定与染色
固定：丙酮或4%多聚甲醛固定10-15秒（防细胞退变）。
染色：
HE染色：苏木素→盐酸乙醇分化→伊红→梯度脱水→封片。
免疫荧光：封闭→一抗4℃过夜→二抗→DAPI复染→封片。
5. 封片与保存：抗荧光淬灭剂封片，切片保存于-20℃。
三、注意事项
1.样本处理：
避免沾水：组织表面液体用滤纸吸干，防冰晶破坏结构。
取材规范：避开坏死、钙化及脂肪区域，组织块大小适中（<1 cm³）。
2.切片质量控制：
温度管理：切片机温度过低导致组织过硬碎裂，过高则切片卷曲。
刀片维护：定期更换刀片，防止组织撕裂。
3.染色与固定：
及时固定：切片后立即固定，防止细胞核模糊。
染色优化：免疫荧光需封闭非特异性位点，降低背景干扰。
4.设备校准：
防冰晶：速冻台预冷充分，避免组织反复冻融。
切片均匀性：使用自动切片机或训练操作员手摇均匀。
四、应用实例
1.临床病理诊断：
术中快速诊断：乳腺癌、肺癌等肿瘤性质判定，指导手术范围。
脂肪组织分析：检测脂肪细胞形态及炎症浸润。
2.药物研发：
组织毒性评估：观察药物对肝脏、肾脏等器官的病理改变。
3.免疫荧光研究：
蛋白定位：检测组织中特定标记物（如CD31、α-SMA）的表达。
五、常见问题与解决方案
|
问题 |
原因 |
解决方案 |
|
切片卷曲 |
组织脱水不彻底或切片速度过快 |
延长脱水时间，降低切片速度 |
|
冰晶空洞 |
组织含水量过高或冷冻速度过慢 |
使用滤纸吸干液体，液氮速冻 |
|
染色背景高 |
封闭不充分或抗体浓度过高 |
延长封闭时间，优化抗体稀释比 |
六、总结
冷冻切片技术通过快速制备和保留组织抗原活性，为临床病理、药物研发和基础研究提供了关键工具。严格遵循样本处理、温度控制和染色优化步骤，可显著提升切片质量，确保实验结果的可靠性。
