一、实验原理
1.凝胶层析法（又称分子筛层析）利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离：
大分子（分子量 > 凝胶排阻限）：被排阻在凝胶颗粒外，沿颗粒间隙优先流出。
小分子（分子量 < 凝胶渗入限）：自由进出凝胶孔，洗脱路径延长，最后流出。
2.关键参数：
排阻限：分子量大于此值的分子被完全排阻。
渗入限：分子量小于此值的分子可自由进出凝胶孔。
3.常用凝胶类型：
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凝胶类型 |
特性 |
适用分子量范围 |
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葡聚糖凝胶（如Sephadex G-75/G-100） |
需预先溶胀，交联度决定孔径；稳定性高，无吸附性。 |
1,000 - 700,000 Da |
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琼脂糖凝胶（如Sepharose） |
孔径大，适用于病毒颗粒；需注意吸附效应。 |
10,000 - 10,000,000 Da |
二、实验步骤
1. 凝胶预处理
溶胀：将干粉凝胶浸泡于洗脱液（如0.025 M KCl-0.2 M乙酸）中，室温过夜或沸水浴加速溶胀。
脱气：装柱前抽真空去除气泡，避免颗粒破碎。
2. 层析柱装填
柱子选择：直径1-1.6 cm，长度根据样品量调整（通常50 cm）。
装填方法：
关闭柱下端，加入1/3柱体积洗脱液。
倾入凝胶，打开下端使凝胶沉降，装至离柱顶5 cm处。
用2-3倍柱床体积洗脱液平衡柱子。
3. 样品加载与洗脱
样品准备：浓度不宜过高（防粘度影响），体积为柱床体积的1%-2%。
洗脱监测：使用紫外分光光度计（如A280）记录洗脱体积（Ve）。
4. 标准曲线绘制
标准蛋白选择：牛血清白蛋白（66 kDa）、卵清蛋白（45 kDa）、胰凝乳蛋白酶原A（24 kDa）等。
线性拟合：以分子量对数（log Mr）为横坐标，Ve为纵坐标，确保R² > 0.99。
5. 分子量计算
根据未知样品的Ve值，通过标准曲线计算其分子量。
三、注意事项
1.凝胶处理：
溶胀时间需充足，装柱前抽真空去除气泡。
2.层析柱维护：
柱内液面始终高于凝胶表面，防止干燥或气泡形成。
3.实验设计：
标准蛋白需与待测样品性质相近，每次实验需重新测定标准曲线。
4.常见问题：
流速控制：过快会导致分离效果下降，需根据柱长和凝胶类型调整。
凝胶污染：使用后需清洗并加入防腐剂（如0.02%叠氮钠），长期保存需干燥处理。
四、实验材料与设备
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类别 |
示例 |
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凝胶 |
Sephadex G-75/G-100（葡聚糖凝胶）、Sepharose（琼脂糖凝胶） |
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标准蛋白 |
牛血清白蛋白、卵清蛋白、胰凝乳蛋白酶原A |
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洗脱液 |
0.025 M KCl-0.2 M乙酸（pH 4.0） |
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设备 |
层析柱（1.1 cm × 100 cm）、核酸蛋白检测仪、部分收集器、紫外分光光度计 |
五、质量控制
1.重复性验证：同一样品多次测量，Ve值偏差应小于5%。
2.标准曲线验证：R²值需大于0.99以确保线性关系可靠。
通过以上步骤，您可实现蛋白质分子量的准确测定。如需进一步优化，可尝试不同凝胶类型或调整洗脱液pH值以适应特定样品需求。
