一、实验步骤
1. 样本制备
裂解细胞或组织：
材料准备：选择含有目的蛋白的细胞或组织样本。
裂解方法：使用超声波破碎仪、反复冻融法或机械方法破碎细胞。裂解缓冲液中含有适量的蛋白酶抑制剂（如0.1-1mM的PMSF），以防止蛋白降解。
离心处理：裂解后，离心去除细胞碎片，收集上清液（含目标蛋白）。
2. 柱子平衡
平衡缓冲液选择：使用平衡缓冲液（如含20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4）多次冲洗亲和柱，确保柱内环境适合目标蛋白结合。
杂质去除：使用去离子水或低浓度洗涤液去除填料中的杂质。
3. 上样与结合
上样操作：将样品缓慢加载到亲和柱上，流速低于0.5 mL/min，保证目标蛋白与填料上的配体充分结合。
重复上样：为提高结合效率，可重复上样2-3次。
4. 洗涤
洗涤缓冲液选择：使用洗涤缓冲液（如含高盐浓度或特定pH值的缓冲液）冲洗柱子，去除非特异性结合的蛋白。
监测流出液：检测流出液中的蛋白含量（如280 nm吸光度），确保杂质被洗脱。
5. 洗脱
洗脱缓冲液选择：使用洗脱缓冲液（如含竞争性配体、低pH值或高盐浓度的缓冲液）破坏目标蛋白与配体的结合。
竞争性配体：如谷胱甘肽（用于GST标签蛋白纯化）。
pH值调整：加入低pH缓冲液。
盐浓度调整：使用高盐浓度或变性剂（如尿素、盐酸胍）。
收集洗脱液：分段收集洗脱液，确保分离纯度。
6. 缓冲液更换与浓缩
缓冲液更换：通过透析或超滤，将蛋白换入适合后续实验的缓冲液中。
蛋白浓缩：使用超滤管浓缩蛋白。
7. 纯度检测
SDS-PAGE分析：通过蛋白电泳检测蛋白纯度。
Western Blot验证：验证蛋白的特异性。
二、注意事项
1. 样本处理
新鲜样本：推荐使用新鲜样本，若不能立即实验，样本可在-80℃保存。
解冻控制：测定时，应控制解冻的温度和时间，室温环境下解冻时，需在4小时内完成样品解冻。
2. 试剂选择
亲和柱选择：根据蛋白的标签或特性选择适合的亲和柱，如Ni²⁺柱（用于His标签蛋白纯化）、GST柱（用于GST标签蛋白纯化）等。
缓冲液选择：避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团、强螯合剂、强还原剂等，以防止对柱子和蛋白的影响。
3. 操作细节
上样流速：上样流速尽量小，保证目标蛋白与填料上的配体充分结合。
洗脱条件：根据蛋白特性优化洗脱条件，如pH值、盐浓度、竞争性配体浓度等。
设备清洁：确保柱子、缓冲液和设备的清洁，避免污染。
三、常见问题及解决方案
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问题 |
可能原因 |
解决方案 |
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目的蛋白得率低 |
细胞裂解效率低 |
优化裂解条件，如加入去垢剂 |
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裂解液粘度过高 |
加入核酸酶降解核酸 |
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层析柱选择错误 |
选择符合目的蛋白标签的亲和层析柱 |
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蛋白稳定性不好 |
添加蛋白酶抑制剂，优化缓冲液 |
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纯化后杂蛋白多 |
标签结合效率低 |
在结合缓冲液中添加竞争性分子 |
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亲和层析洗脱条件不当 |
优化洗脱条件，如调整pH值、盐浓度 |
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宿主蛋白残留 |
添加核酸酶降解宿主核酸 |
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镍柱使用中出现棕色 |
缓冲液中有DTT |
尽量避免DTT的参与 |
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柱子堵塞 |
样品中细胞碎片或其他杂颗粒 |
样品高速离心后再上样 |
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蛋白变性 |
超声太剧烈或时间过长 |
控制超声功率和时间 |
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蛋白沉淀 |
缓冲液pH值不当 |
调整缓冲液pH值 |
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蛋白浓度过高 |
降低蛋白浓度 |
通过以上指南，您可以更顺利地开展蛋白纯化系统亲和实验，提高实验成功率。如有问题，建议查阅相关文献或联系技术支持。
