一、实验原理

游离胆固醇（fCHOL）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒采用双抗体夹心法或竞争法，通过酶标仪测定吸光度（OD值），根据标准曲线计算样品中游离胆固醇（fCHOL）的含量。

双抗体夹心法：往预先包被抗体的微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的游离胆固醇（fCHOL）含量呈正相关。

竞争法：用纯化的游离胆固醇（fCHOL）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入游离胆固醇（fCHOL）和HRP标记的游离胆固醇（fCHOL）抗原，使它们竞争结合。经过彻底洗涤后加底物TMB显色。样本颜色的深浅和样品中的游离胆固醇（fCHOL）含量呈负相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中游离胆固醇（fCHOL）的含量。

 

二、操作步骤

1. 实验前准备

试剂和标本平衡：将所有试剂和标本缓慢均衡至室温（18-25℃），试剂不能直接在37℃溶解。

标准品稀释：按照说明书要求稀释标准品，准备标准曲线。

检测溶液准备：检测溶液A及检测溶液B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A或B按1:100稀释，充分混匀。

洗涤液稀释：用蒸馏水或去离子水将浓洗涤液稀释至工作浓度。

2. 加样

设置孔位：分别设标准孔、空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。

加样操作：在酶标包被板上标准孔中加50微升标准品，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育

封板：用封板膜封板。

温育条件：将酶标板置于37℃温育60分钟。

4. 洗涤

揭膜：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干。

洗涤操作：每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5. 显色

加显色剂：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀。

显色条件：37℃避光显色15分钟。

6. 终止

加终止液：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

7. 测定

调零：以空白孔调零。

测定OD值：用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

8. 计算浓度

标准曲线绘制：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

样品浓度计算：根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

 

三、注意事项

1.试剂准备：

使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温（18-25℃），避免试剂直接在37℃溶解。

浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

2.标准品稀释：

按照说明书要求稀释标准品，准备标准曲线。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

3.加样和温育：

加样时尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

温育时确保温度和时间准确，用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

4.洗涤：

洗涤时确保每孔加满洗涤液，静置后弃去，重复洗涤数次，确保洗涤充分。

手工洗板时，吸去或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次。

5.显色和终止：

显色时避光操作，确保显色时间准确（37℃避光显色15分钟）。

终止时立即加入终止液，确保反应终止。

6.测定和计算：

测定时确保波长（450nm）和测定时间准确。

计算时根据标准曲线和样品稀释倍数计算样品浓度。

7.其他注意事项：

封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

底物请避光保存。

严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

本试剂不同批号组分不得混用。

 

四、常见问题及解决方案

问题	可能原因	解决方案
显色淡或灵敏度低	试剂盒未充分平衡	将试剂盒充分平衡至室温
	样品不适合做ELISA检测	选择合适的样品形式
	酶标板过分干燥	避免酶标板过分干燥
背景深或全部呈有色	洗涤不充分	充分洗涤
	底物污染	使用新鲜的底物溶液
重复性不佳或高CV值	样品不均一	加样前充分混匀样品
	加样量不一致	使用同一移液器并装紧吸嘴
标准曲线差	标准品稀释不正确	确保标准品正确溶解和稀释
	移液不准确	定期校准移液器