一、实验原理
磷酸钙转染法是一种常用的将外源DNA导入真核细胞的方法。其基本原理是：在特定条件下，DNA与磷酸钙形成共沉淀复合物，这些复合物能够吸附在细胞表面，并通过内吞作用进入细胞。进入细胞后，DNA可能整合到宿主基因组中，或在细胞质中保持游离状态，随后在细胞核内表达相应的蛋白质。
具体来说，当将溶解的DNA与氯化钙溶液混合时，再逐渐加入磷酸盐缓冲液，就会形成磷酸钙-DNA共沉淀物。这些共沉淀物带有正电荷，能够吸附在带负电荷的细胞表面，进而被细胞摄取。
二、实验步骤
1.细胞准备
在转染前一天，将细胞接种到合适的培养板中，确保细胞在转染时达到对数生长期，且细胞密度适中（一般为60%-80%汇合度）。
2.DNA准备
将待转染的质粒DNA用无菌去离子水或TE缓冲液稀释至适当浓度。
3.转染试剂配制
2×HBS溶液：通常含有50 mM HEPES、280 mM NaCl、1.5 mM Na₂HPO₄，用NaOH调节pH至7.05-7.15，过滤除菌后分装，-20°C保存。
CaCl₂溶液：常用浓度为2.5 M，过滤除菌后分装，-20°C保存。
4.转染复合物制备
在无菌离心管中，将一定体积的质粒DNA（如10-20 μg）加入无菌去离子水中，使总体积达到一定量（如50 μl）。
缓慢加入CaCl₂溶液（如50 μl 2.5 M CaCl₂），轻轻混匀。
逐滴加入2×HBS溶液（如500 μl），边加边轻轻振荡，室温孵育20-30分钟，形成磷酸钙-DNA共沉淀物。
5.细胞转染
将形成的磷酸钙-DNA共沉淀物逐滴均匀加入含有细胞和培养基的培养板中，轻轻晃动培养板，使复合物均匀分布。
将培养板放回二氧化碳培养箱中，继续培养4-16小时（具体时间根据细胞类型而定）。
6.转染后处理
转染结束后，吸去含有转染复合物的培养基，用PBS轻轻冲洗细胞一次。
加入新鲜的培养基，继续培养细胞至所需时间，以便检测转染效果。
三、注意事项
1.细胞状态：确保细胞在转染时处于良好的生长状态，避免使用老化或死亡的细胞。
2.DNA质量：使用高质量的质粒DNA，避免DNA降解或污染。
3.转染条件：优化转染条件，如DNA浓度、CaCl₂浓度、HBS的pH值等，以提高转染效率。
4.操作轻柔：在转染过程中，操作要轻柔，避免对细胞造成机械损伤。
5.无菌操作：整个转染过程应在无菌条件下进行，避免细菌或真菌污染。
