一、实验材料
1.材料来源：人眼、兔眼或猪眼等。
2.清洗液：不含Ca²⁺和Mg²⁺的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2。
3.器械：小梁剪、无齿镊等。
4.消毒液：200IU/ml的庆大霉素生理盐水。
5.培养液：
基础液：由DMEM培养基加入HEPES 6.0g/L、NaHCO₃ 2.2g/L以及L-谷氨酰胺0.06g/L配制而成。
应用液：在基础液内补加15%的胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml，并用5% NaHCO₃调节pH至7.0~7.2。
6.培养器皿：培养瓶、24孔培养板或培养皿若干。
二、实验方法
1.眼球处理：
将离体的供体眼球用200IU/ml的庆大霉素溶液浸泡消毒5分钟。
在无菌条件下，沿角膜缘后5mm处环形剪开眼球，剪断晶状体悬韧带，去除晶状体和玻璃体。
2.小梁组织分离：
将眼前段倒放在培养皿中，在显微镜下用无齿镊把虹膜抹离角膜内皮面，暴露房角结构。
以PBS溶液或平衡盐溶液轻微冲洗小梁组织表面。
用小梁剪伸入Schlemm管，楔形剪取小梁组织，前界至Schwalbe线，后界至巩膜嵴。环形取出一块小梁组织，置于培养皿中。
3.组织接种：
经PBS漂洗后将小梁组织剪碎，几乎成浆状。
用无齿镊挑起少许小梁组织，接种于24孔培养板或培养瓶中，轻轻铺平。
待组织稍干后加入适量培养液，在CO₂培养箱静置培养。
4.细胞培养与传代：
第四天后开始换液，每周2次。
当原代培养的细胞分裂、增殖、融合形成单层时就需要传代。传代时先用弯头吸管吸去培养液，用D-Hank液对细胞稍做洗涤，加入混合消化液，室温下消化1~3分钟。
在倒置显微镜下观察，当见到细胞开始收缩变圆时，即吸去消化液，加入有血清培养液以终止胰酶对细胞的作用，并用弯头毛细吸管反复有序地吹打细胞瓶底部，把脱落物制成细胞悬液。
通过离心除去含酶溶液，用培养液重新悬浮细胞，做细胞计数，以4×10⁵~6×10⁵/mL的密度，接种至培养板或培养瓶中。
三、注意事项
1.无菌操作：整个实验过程需要严格遵守无菌操作规范，以防止细胞污染。
2.组织处理：在剪取和剪碎小梁组织时，需要尽量精细操作，以避免对细胞的损伤。
3.培养条件：细胞培养需要在适宜的温度、湿度和CO₂浓度下进行，以促进细胞的生长和增殖。
4.观察与记录：定期观察细胞的生长状态和形态变化，并记录相关数据，以便及时发现问题并进行调整。
