一、原理
密度梯度离心基于不同物质颗粒（如细胞、细胞器、大分子等）在密度梯度介质中的沉降速度或浮力密度差异进行分离。当样品在密度梯度介质中进行离心时，各组分将移动到与其密度相等的介质区域，形成明显的区带，从而实现分离。
二、类型
1.速率区带离心法（速度沉降）
原理：根据颗粒的沉降速度差异进行分离。
特点：离心时间短，适合分离密度差异较大的颗粒。
应用：常用于分离细胞器、病毒等。
2.等密度区带离心法（平衡密度梯度离心）
原理：利用颗粒的浮力密度差异进行分离。
特点：离心时间长，但分离效果好，适合分离密度相近的颗粒。
应用：常用于分离核酸、蛋白质等生物大分子，以及脂蛋白的分离。
三、应用
1.生物大分子分离
核酸分离：如质粒DNA的提取，通过CsCl-EB密度梯度离心可去除蛋白质、RNA等杂质，获得高纯度的质粒DNA。
蛋白质分离：利用密度梯度离心可分离不同密度的蛋白质组分。
2.细胞器分离
通过速率区带离心法可分离线粒体、叶绿体、过氧化物酶体等细胞器。
3.脂蛋白分离
利用等密度区带离心法可分离极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）等脂蛋白组分。
四、操作要点
1.密度梯度介质的制备
选择介质：常用的密度梯度介质有蔗糖、CsCl、Percoll等。
制备梯度：可通过连续梯度或不连续梯度的方式制备密度梯度。连续梯度可通过梯度混合器制备，不连续梯度则通过逐层叠加不同密度的介质形成。
2.样品处理
样品准备：确保样品均匀且不含大颗粒杂质。
加载样品：小心地将样品加在密度梯度介质的顶部或特定位置。
3.离心条件
离心机选择：根据实验需求选择合适的离心机，如超速离心机或高速离心机。
离心参数：设置合适的离心速度、时间和温度。离心速度和时间需根据样品特性和分离目标进行优化。
4.结果分析
区带观察：离心结束后，通过观察区带的位置和形态判断分离效果。
组分收集：使用穿刺法或切割法收集目标组分，并进行后续分析。
五、注意事项
1.安全操作
离心机使用：确保离心机平衡放置，避免超速运转导致损坏或危险。
介质处理：某些密度梯度介质（如CsCl）具有毒性，需按实验室安全规定处理。
2.实验优化
梯度优化：根据样品特性和分离目标优化密度梯度的范围和斜率。
参数调整：通过预实验确定最佳离心速度和时间，以提高分离效果。
3.结果验证
纯度检测：使用光谱分析、电泳等方法检测分离组分的纯度。
活性检测：对于生物大分子或细胞器，需检测其生物活性或功能。
六、常见问题及解决方案
1.区带不明显
原因：可能是密度梯度范围不合适或离心速度、时间不足。
解决方案：调整密度梯度范围或优化离心参数。
2.分离效果不佳
原因：可能是样品处理不当或介质选择不合适。
解决方案：改进样品处理方法或选择更合适的介质。
3.离心管破裂
原因：可能是离心管质量不佳或离心机运转异常。
解决方案：更换质量可靠的离心管或检查离心机运转情况。
