一、仪器因素
1.CCD性能：
分辨率：CCD的分辨率取决于像素的多少和CCD尺寸的大小。大像素点能够增加灵敏度，但分辨率会下降；小像素点能够增加分辨率，但单位像素面积减小会降低感光性能。
信噪比：信噪比的高低对成像质量至关重要，它不仅与CCD本身有关，还与系统的整体配置和环境密切相关。
动态范围：动态范围的变化以bit值来表现，用来描述生成的图像所能包含的颜色数，即灰阶。深度较大的CCD才能准确表现所检测到的荧光信号的微小差异。
量子效率：高量子效率的CCD能够更有效地捕捉光信号，提高成像质量。
温度控制：温度对CCD的暗电流有影响，进而影响信噪比。一般情况下，温度越低，暗噪声越低，但过低的温度会增加乱真电荷，因此存在一个最佳温度。
2成像暗箱：暗箱可以屏蔽外界光源，确保CCD检测的光线完全由被检动物体内发出，避免光污染。
3.软件系统：软件系统负责仪器控制和图像分析，其稳定性和准确性对成像结果有重要影响。
二、实验因素
1.底物给药方式：
腹腔注射：底物迅速分布全身，并能穿过血液组织屏障。注射后10~20分钟，发光信号达到峰值；60分钟内逐渐减少，直至不可检测。
尾静脉注射：可提供更好的再现性和5~10倍的高信号，但注射难度较高，代谢较快。
建议：第一次使用荧光素酶底物成像或更换新品牌底物时，需要进行预实验，观察底物在何时达到峰值，确定注射荧光素底物和成像之间的最佳延迟。
2.荧光标记物波长：
自发荧光干扰：大多数生物体内都表现出一种天然的荧光，这些荧光与标记物发射波长重叠时，会导致低信噪比，检测灵敏度受限。
建议：使用近红外波长的荧光染料，优点是更高信噪比，穿透更深；或使用iRFP作为报告基因，该荧光蛋白具有更高的亮度、光稳定性和信噪比。
3.动物毛发：
光信号衰减：动物毛发对光具有吸收及散射作用，会导致光信号衰减。
建议：成像前一天，需要通过剃毛或化学脱毛来去除观察区域的毛发，以便最大限度地收集信号。
4.曝光时间：
影响：曝光时间的延长会增加目的信号，但也会放大背景噪音。
建议：同一批实验应保持一致的曝光时间，同时还应保持标本相对位置和形态的一致，以减少实验误差。
5背景荧光：
来源：背景荧光主要来源于皮毛和血液的自发荧光，以及动物尿液或其他杂质。
建议：进行荧光成像时，实验者可选择背景荧光低不容易反光的黑纸放在动物标本身下，减少金属载物台的反射干扰。
6.阈值设置：
影响：阈值的改变会影响实验结果的分析。
建议：在分析信号光子数或信号面积时，应考虑阈值的改变对实验结果的影响。正确选择ROI区域，可提高分析实验数据的准确性。
三、生物因素
1.细胞系的选择：不同细胞系表达蛋白的能力不同，会影响荧光成像的结果。
2.启动子的强弱：重组基因或融合蛋白的表达情况由启动子的强弱来控制，强启动子能够增加荧光强度。
3.动物体温度：生物荧光成像受底物浓度和动物体温度的影响，活体成像系统的暗箱和检测平台应保持良好的恒温状态。
